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包埋皿からスムーズにパラフィンブロックを外す方法。
今までは、パラフィン包埋をするのに陶器?の包埋皿にグリセリンを塗って使用していたのですが、今回包埋カセットを利用できるようにティシューテックのステンレスの包埋皿を購入しました。
しかし、この包埋皿からうまくブロックを取り出すことができません。ブロックの取り出しのコツをご教授いただければと思い質問させていただきました。
初歩的なことで申し訳ございませんが、よろしくお願いいたします。

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A 回答 (3件)

> 周辺温度を-5℃程度に


> できれば特別なことをしなくても外れる

と思いますよ。大昔、台木から外して包埋し直すときに、冷凍庫に
入れとくだけでみんなとれちゃいましたから。

大量に薄切してみれば、急速に均一に冷却されたパラフィンの切り
やすさは実感出来るはずです。翌週もう1ダース追加で薄切するは
めになれば、ティシューテックに感謝することになります。この道
四半世紀になりますが、スライドグラスを特注するような大型標本
でない限り、ティシューテックを使わないって選択肢は勘弁してほ
しいですね。
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この回答へのお礼

たびたびのご回答ありがとうございます。
クール便の発泡スチロールに製氷機の細かい氷を敷き詰めてそれに
乗せて放置していたら簡単に取ることができました。
ただ、ヒビが入ってしまったので時間調整を少ししないといけないですね。
今までは流水中で冷やしていたので今回からの薄切が楽しみです。

お礼日時:2010/06/30 08:32

私はそんなに専門的な物品を使ってやったことが無いので、


どうしてそんなに必要なのかわかりませんが、

私はお弁当や小さなカップケーキを作るときに使う
アルミでできたカップを使って包埋してます。

パラフィンが固まったら、アルミをはぐだけでOKですので。
そうじゃなくても、実験用にアルミのカップは売ってあると思います。
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この回答へのお礼

ご回答ありがとうございます。
私も最初はあまり気にせずに教室に最初からあった陶器の包埋皿を使用していたのですが、
ティシューテックの包埋皿と包埋カセットを利用してやれば薄切を行う際の面出しの調節を
個々にしてやらなくて済むと思ったので購入した次第です。
最初は高く感じましたがこれから何十年かお世話になると思ったので手間ひまを考えると
いいかなぁと思ってます。

お礼日時:2010/06/30 08:27

> 陶器?の包埋皿にグリセリンを塗って


> ティシューテックのステンレスの包埋皿を購入

ティシューテックのクライオコンソールは買わなかったんでしょう
か。陶器、ステンレス、パラフィン、すべて収縮率が違うので、ク
ライオコンソールの上に並べとくだけで勝手に外れます。
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この回答へのお礼

早速の回答ありがとうございます。
クライオコンソールは非常に欲しいのですが、いかんせん予算が・・・。
並べておくだけで勝手に外れるということは、周辺温度を-5℃程度に
できれば特別なことをしなくても外れるということでしょうか?

お礼日時:2010/06/27 10:24

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Qパラフィン切片について

こんにちは、いつもお世話になってます(^_^)

皮下組織を含む皮膚組織を包埋した
パラフィンブロックを薄切して
3μm厚のパラフィン切片を作製しています。

薄切するところまではいいのですが…、
悩みは次の二つです。
(1)伸展版にスライドグラスを置いて
 30分くらい経って切片を見てみると
 組織のなかに(スライドグラスと切片の間に)
 泡ぶくというか水泡のような盛りあがり
 ができている。

(2)脂肪組織を多く含む大きめの切片は
 伸展版にのせておくと花開くように
 分解して組織がくずれてしまう。

原形を保ったままきちんとスライドグラスに
貼り付けたいです…。
改善できるよい方法をお知りの方、ご教授願います。
ちなみに、
使っているスライドグラスはアルブミンスライドです。
伸展版にのせたあとは十分に水分をろ紙で除いています。
伸展版の温度は45~48度の設定です。
油分が残らないように手はしっかり洗ってから行っています。

Aベストアンサー

一番考えられる要因は、伸展台の温度が高いことです。温度設定は教科書通りでも、実際の温度が表示温度よりも高い場合があります。
脂肪組織が解離しやすいのもこれが特に大きな要因になります。
乾くのに時間が掛かっても仕方がないと思い、伸展台の温度をもう5℃ほど低めに設定されてみてはいかがでしょうか?

またもう一つ考えられる要因は、切片とスライドグラスの間に水分が残っていることです。切片をスライドグラスに載せた後は、スライドグラスを傾け、しっかりと濾紙に水分を吸い取らせる必要があります。
私の場合は、伸展台にキムタオル(薄い1枚にした物)を伸展台の上に敷き、切片をスライドグラスに載せた後、スライドグラスを傾けて、なかなか切片の下の水分が切れない場合は、切片の角を少し破って、そこに濾紙を当てて吸い出してました。こうすると、水泡のような物が出にくくなります。

さらに、薄切して切片をスライドグラスに取る前に、水ではなくお湯を使われていますか?この場合、お湯が高いと、当然脂肪組織は解離しやすくなりますので、温度には注意する必要があります。人肌より少し温かい位が適温です。水よりもお湯の方が伸びが良いので、お湯を使うこと自体は悪くないと思います。
さらに、私は脳組織を主に薄切していたのですが、その際には、1%酢酸水を温めたものに切片を浮かせて伸ばし、スライドグラスにすくってました。こうすると、きれいにしわもなく伸び、他の組織切片を作製する際も、多少臭いですが、きれいに仕上がるのでこの方法で行ってました。

一度お試しあれ…。

一番考えられる要因は、伸展台の温度が高いことです。温度設定は教科書通りでも、実際の温度が表示温度よりも高い場合があります。
脂肪組織が解離しやすいのもこれが特に大きな要因になります。
乾くのに時間が掛かっても仕方がないと思い、伸展台の温度をもう5℃ほど低めに設定されてみてはいかがでしょうか?

またもう一つ考えられる要因は、切片とスライドグラスの間に水分が残っていることです。切片をスライドグラスに載せた後は、スライドグラスを傾け、しっかりと濾紙に水分を吸い取らせる必要があり...続きを読む

Q組織の固定処理から包埋に移る際に

パラフィン処理をすると思うんですが、流動パラフィン(和光社製)
で行えばよろしいのでしょうか?

はじめて組織切片をつくるため色々な本を参考にしてはいるのですが、
パラフィンのことは特に何も書いていないので良くわからないので質問させていただきました。

回答宜しくお願いします。

なおプロトコルは東京大学ラボマニュアルー核内情報研究分野を参考にしています。

Aベストアンサー

パラフィンは60℃の恒温器であらかじめ溶かしておきます。恒温器は汚れますから、専用のものにします。サイズは組織の量にもよりますが、最低でも100mLビーカーが3つ以上入るサイズにしましょう。大きい方が開けたときの温度低下が少ないので良いです。温度が下がると瞬く間にパラフィンが硬化してしまいます。パラフィンの種類は組織用のもので、55℃位の低融点ものから60℃以上の高融点のものまであります。低融点のものは大きな組織に有効ですが、高融点のものは切片を切るとき硬めなので切りやすいです。汎用は58-60℃の融点のものでしょう。

5mm角以下の組織であれば、70,80,90,95,100%エタノールを1-3時間ずつ室温で浸漬していきます。組織によっては浸透しにくいものもありますので、これは経験になりますが、極端に長くならなければ大丈夫ですので、不安なら多めに浸漬すると良いでしょう。100%エタノールは3回ほど通し、完全に水分を除去します。その後キシレンを1-1.5時間、計3回移し、60℃のパラフィンに浸漬します。キシレンとパラフィンの間にXyl:para=1:1に浸漬するとパラフィンが浸透しにくい組織に有効です。この時に流動パラフィンを使うこともできますが、Xyl/paraで十分です(しなくても良いです)。60℃のまま、恒温器の中で30-60分ずつ計3回ビーカーの組織を移していきます。
包埋する際には、予め温めた包埋皿(ステンレス製のものがありますが、アルミホイルで型を作った方が安い)に60℃のパラフィンを注ぎ、組織を沈めます(切る方向が底面からになりますので方向性を確認して)。軍手をしないと熱いです。ピンセットはアルコールランプやガスバーナーで熱しながら組織を扱います。ホットプレート(低温60℃程度にできるもの)があると余裕ができるので楽です。自然に室温に放置しておけば固まります。台木などに熱したスパーテルで貼り付けてミクロトームで切ります。

とにかく、周辺がパラフィンで汚れますので、器具はパラフィン専用とし、実験台にも新聞紙を敷きましょう。もし汚れたらキシレンを浸み込ませたペーパータオルで拭きます(臭いので換気して)。

パラフィンは60℃の恒温器であらかじめ溶かしておきます。恒温器は汚れますから、専用のものにします。サイズは組織の量にもよりますが、最低でも100mLビーカーが3つ以上入るサイズにしましょう。大きい方が開けたときの温度低下が少ないので良いです。温度が下がると瞬く間にパラフィンが硬化してしまいます。パラフィンの種類は組織用のもので、55℃位の低融点ものから60℃以上の高融点のものまであります。低融点のものは大きな組織に有効ですが、高融点のものは切片を切るとき硬めなので切りやすいです。汎用は58...続きを読む

Q動物組織切片作成のパラフィン包埋について

動物の組織切片標本を作ろうと思っています.自動包埋機がなく,パラフィン包埋(エタノールで脱水→キシレン→パラフィン)を1日でやるのはすこしきびしいので,どこかの工程で一夜置いておこうと思うのですが,どこが一番よいでしょうか?また,ここであまり長く置くとよくない,というところがありますか?

よろしくお願いします.

Aベストアンサー

最初に70%程度の低濃度アルコールで一晩置くと、後の処理がスムーズで、なおかつ組織の収縮も少ないです。アルコール濃度が高くなると、その分組織の収縮もきつくなります。ですが、あまり組織片が小さすぎると、かえって収縮がきつく起こる可能性もありますので、ゆっくりと時間を掛ける場合は、気をつけた方が良いでしょう。

パラフィン層で長時間置くのは避けるべきです。熱が掛かっている分、やはり組織へのダメージは強くなるわけですから。キシレンまで済んでしまえば、浸透器があるのでしたら、そこで1時間ずつ3層パラフィンを置けばいいでしょう。

組織標本の作製は、どの組織をターゲットとするかでも違ってきます。脂質の多い脳などでは、アルコール処理を長めにして、十分に脱脂効果を狙って包埋していく工程を取ったりします。

Q染色についての疑問なのですが、誰か教えて下さい。

病理学実習で行った最も有名で、1番popularなHE染色についてなのですが…
(1)今回実習で行ったのは、カラッチのヘマトキシリンだったのですが、他には、どんな種類が存在しますか?
(2)カラッチのヘマトキシリンを作ったときに、いろいろな物を加えました。それで、ナノですが、ヘマトキシリン液についての原理を知れば、入れた物質の役割が分かるのではないかと考えました。そこで、質問です!!ヘマトキシリン液の原理って、何ですか?
(3)染色には、退行性と進行性があり、退行性の染色液には、”分別”と言う操作が、必要って、文献に書いてあったのですが…分別には、どんな種類の薬品を使うのですか? 実習では、0.25%塩酸を用いました。
(4)試薬が、良ければ、色出しの操作は、不要みたいなのですが、色出しって、何なのですか?色出しには、どんな試薬が、使われているのですか?

だれでも良いので、こんな馬鹿な私に教えて下さい。

Aベストアンサー

実習の時に質問すりゃぁいいのに…ま、病理医にはわからんか。

私の場合普段はマイヤーの処方を薄い切片用にアレンジした「ダブ
ルマイヤー」を常用していますが、必要ならカラッチやギルも調整
します。ハリスは水銀を使うからパス。ワイゲルトの鉄ヘマトキシ
レンはHE染色用ではありません。

処方の基本は、「色素」+「酸化剤」+「媒染剤」です。酸化剤には
ヨウ素酸ナトリウムを常用します。これで無色のヘマトキシレンが
ヘマティン色素になります。媒染剤は金属イオンを添加して色ラッ
クを形成させ組織との結合を強くするもので、ミョウバンを使うと
青紫になります。ここで鉄を使うと茶褐色っぽい色になりますね。
最後に安定剤として抱水クロラールやグリセリンを混ぜて完了。色
ラックが正に帯電しているため、負に帯電するリン酸基やカルボキ
シル基と結合しやすいわけです。

分別ですが、上記の理屈で染まるからにはpHの影響ってモノを受け
るわけで、pHが4くらいだと結構なにもかも染まってくるんです。こ
れを、染めた後で塩酸アルコールなどでpHを下げて、リン酸基のと
ころだけ残してカルボキシル基のところを脱色してやるのが「分
別」という作業です。全体を染めてから要らないところを抜くから
「退行性染色」。逆に最初っから酸を加えてpH2とかの染色液を作
り、リン酸基リッチのところしか染まらないようにしたのが「進行
性染色」。カラッチが退行性染色の代表で、マイヤーが進行性染色
の代表です。

色出しってのは、ヘマトキシレンで染色した後でしばらく流水で洗
うステップですが、これはpHを上げています。すると水素イオンが
色ラックに干渉し難くなり、赤褐色から安定した青紫色になって、
褪色もしなくなります。

以上、藍染めと全く同じだよっていう話でした。

実習の時に質問すりゃぁいいのに…ま、病理医にはわからんか。

私の場合普段はマイヤーの処方を薄い切片用にアレンジした「ダブ
ルマイヤー」を常用していますが、必要ならカラッチやギルも調整
します。ハリスは水銀を使うからパス。ワイゲルトの鉄ヘマトキシ
レンはHE染色用ではありません。

処方の基本は、「色素」+「酸化剤」+「媒染剤」です。酸化剤には
ヨウ素酸ナトリウムを常用します。これで無色のヘマトキシレンが
ヘマティン色素になります。媒染剤は金属イオンを添加して色ラッ
クを形成さ...続きを読む

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Q病理組織切片の切り方について

とある病理組織をパラフィン包埋した後、ミクロトームで切片を切ろうとしたのですが、きれいに切れません。パラフィンのところはきれいに切れたのですが、組織のところでボロボロになってしまいます。ミクロトームの刃を代えてもだめで、いろいろ条件を変えてみてもだめでした。包埋しなおした方がいいのでしょうか?何か解決策があれば教えてください。ちなみに厚みは4μです。

Aベストアンサー

まず、切る時ですが、経験的にパラフィンブロックは少し暖かいほうが切りやすいです。冷たいままだとうまくいきません。
私は、夏はいいですが、冬には37℃のインキュベーターに数分いれて温めてから切り始めます。
少し暖かい環境のほうが切りやすいです。剃刀の歯とかもしかりです。

次に、包埋時ですが、透徹に使う有機溶剤(キシレンなど)にはあまり長くつけすぎると組織が硬くなって切りづらい場合があります。
また、パラフィンにつけておく時間を24時間とか長くすることで、切りやすくなた組織もありました。

あとは、少し厚い切片から切る練習をしてみるとかでしょうか。

思いつくままに、参考まで。

Q「精一杯がんばります」を言い換えると?

クライアントから、かなり難しい案件を任されました。
しかし、今後につながる大切な仕事なので、良い結果を出すために全力を尽くしたいと思います。

そこで、その旨を伝えるべく、返信のメールを出す段になって、はたと困りました。

ビジネス文書なので、もちろん「精一杯がんばります」とは書けません。
「鋭意努力します」なども考えたのですが、仕事はそもそも一生懸命するのが当たり前なので、「がんばる」とか「努力する」とかいう言葉は使わない方がいいですよね。
「尽力」などは、自分のことにはあまり使わないし、傲慢な感じ(押し付けがましい感じ)がすると思います。

そこで、質問です。
謙虚な感じは残しつつ、全力で取り組むことをアピールするのに、ぴったりな表現はないでしょうか。
皆様のアドバイスをお願いいたします。

Aベストアンサー

「○○様(貴社?)のご期待に添えますよう、社員一同全力をもって取り組んでまいりたいと考えております。」

というかんじではいかがでしょうか?

Qブロッキングに使用するスキムミルクの作製方法

免疫染色を行う際のブロッキングに使用するスキムミルクの作製方法について教えてください。 現在免疫染色を行う際にブロッキング剤として森永のスキムミルクをPBSで溶解させて使用しています。しかし、2%で作製したつもりでも完全に溶けてくれないため時間をあけてから上清を取って使っています。これでは2%ですらないですよね?
スキムミルクが安価なためスキムミルクの正しいブロッキング剤の作製方法をご教授いただければと思います。
素人な質問で大変申し訳ありませんがよろしくお願いします。

Aベストアンサー

ちょっと補足しておきます。
カゼインはセリン残基が豊富で、それらが高度にリン酸化されており(リン酸化タンパク質に対する抗体のブロッキングに不適当なのはそのためです)、リン酸基がナトリウムやカルシウムと塩を作っています。カゼイン-リン酸カルシウムという、そうでなくても溶解度の低そうなものを、さらにリン酸バッファーで溶かすということは、容易でないことが想像できるでしょう。


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