A 回答 (2件)
- 最新から表示
- 回答順に表示
No.2
- 回答日時:
loving-boyさん こんにちは
プロトコール通りやっているのに、シークエンスデータがNNNNNNNNで終わってしまうということは、エタ沈で視覚的に確認した遺伝子断片は、おそらく、目的の遺伝子断片ではなかったか、あるいは、少なくともプライマーと同じ塩基配列の部位がほとんど存在しないPCRエラー箇所の多い目的遺伝子断片と考えられます。
cDNAを得る際に、エタ沈で視覚的に確認するとともに、電気泳動で目的のバンドを確認していると思いますが、その際に用いるプライマーは、サイクルシークエンスを行う際に用いた目的遺伝子断片用のプライマーでなく、ベクター由来のプライマーではないでしょうか?
この段階で、サイクルシークエンスを行う際に用いた目的遺伝子用のプライマーでPCRを行い、電気泳動で目的遺伝子断片のバンドを確認しておきましょう。
もしも、上記の方法で目的遺伝子断片のバンドを確認出来なかったならば、ベクターに導入されていた遺伝子断片はPCRエラー箇所の多い遺伝子断片であったと考えられます。
手技のうえでコツとしては、サイクルシークエンスを行う際に、用いるプライマーをベクター由来のプライマーで行えば、PCRエラーの多い目的遺伝子断片であろうとも、塩基配列の解読が行えます(自分がクローニングした遺伝子断片が何者かが分かる)。
成功を祈ります。
No.1
- 回答日時:
詳しいことがわからないので可能性を列挙します。
どこで、NNNがでてくるかもお書きになっていないので、全くシークエンスが出来ていないという状況としてです。1)タンパクなどDNAサンプルへのコンタミ。エタ沈でペレットが出来てもそれがピュアなDNAである保証はないです。フェノール・クロロフォルム、あるいは適当なキットを用いてタンパクを除くことも考慮にいれてください。
2)プライマーがSitdownしていない。アニーリング温度は検討しましたか?はたらくことが明らかになっているプライマーなのですか?いくつかのプライマーは使いましたか?T7, M13、などUniversal プライマーも同時に使いシークエンスのシステム自体が動いていることを確認する必要があるかもしれません。
3)cDNAが極端にGC-Richである。私もGCが80-90%というcDNAをシークエンスしてことがありますが、DMSO,温度、時間など微妙な条件を検討しました。
4)まさかとは思いますが、cDNAがTEに融けているとシークエンスはできないことはご存知ですよね。
まぁ、とりあえずここらあたりから検討されてはいかがでしょうか?
この回答へのお礼
お礼日時:2010/08/27 03:08
ありがとうございます。フェノクロ処理をしてみようと思います。プラスミド抽出したのですが、とれたプラスミドが汚い・少ないとシーケンスできないということはないのでしょうか
お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!
似たような質問が見つかりました
- デート・キス エッチを持ちかける方法について 4 2023/06/08 20:46
- 預金・貯金 ゆうちょ銀行の通常貯蓄預金について 4 2022/03/31 10:55
- その他(暮らし・生活・行事) リレー、マグネットスイッチで教えてください・・・ 1 2022/04/08 18:33
- 運輸業・郵便業 旦那の会社がPCR受けるな、簡易キットで十分と言う 1 2022/03/24 21:09
- JavaScript javascriptで文字分割は、 split() などメソッド不要??? 4 2023/02/06 22:50
- 銀行・ネットバンキング・信用金庫 みずほ銀行(普通口座)の通帳を見たところ、半年記帳していなかった分が省略されており、振込などの金額が 3 2023/02/23 21:59
- その他(悩み相談・人生相談) 自分は、上手くいく時と行かないときの差が大きいです。上手くいった日は1日すごく楽しく、ある程度何もか 3 2022/05/23 20:10
- 心理学 叱責 やる気をなくす 受動的 身内の人に、毎日叱責を受けます。 自分が根本的な原因を作っているのです 8 2022/08/08 00:00
- Visual Basic(VBA) エクセルのマクロについて教えてください。 1 2023/03/07 14:05
- 出会い・合コン ワンナイトの経験がある人の特徴 2 2022/10/08 21:13
おすすめ情報
デイリーランキングこのカテゴリの人気デイリーQ&Aランキング
-
妻が作る子供は、元彼たちとの...
-
生き物が他の生き物を食べる日理由
-
生物 この問題の答えを解説付き...
-
素朴な疑問です。 親子、兄弟、...
-
摂食交配
-
彼女が生でやらせてくれません...
-
ショウジョウバエの赤い液
-
近親婚の子供が障害を持つ可能...
-
二重乗換えが起こるときの乗換...
-
なぜ 兄弟姉妹同士では 結婚で...
-
【生物】優性遺伝子が劣性遺伝...
-
iPS細胞でクローン人間は作れる?
-
少子高齢化対策としてただ子供...
-
遺伝子シンボル名のLOCの意味
-
タンパク質のファミリー/ホモロ...
-
なんで種の繁栄をしなくちゃけ...
-
なんで兄弟は同じ親から生まれ...
-
美男・美女だけが生き残る?
-
近親相姦(姉ー弟)
-
髪の色と遺伝について
マンスリーランキングこのカテゴリの人気マンスリーQ&Aランキング
-
妻が作る子供は、元彼たちとの...
-
素朴な疑問です。 親子、兄弟、...
-
彼女が生でやらせてくれません...
-
摂食交配
-
なぜ 兄弟姉妹同士では 結婚で...
-
どんなヤリマンでもしっかり結...
-
ショウジョウバエの赤い液
-
自分の血液型の遺伝子がAOなの...
-
null mutantって?
-
DNAとRNAの違いについて
-
種の保存と言う法則は厳密には...
-
祖父と祖母の遺伝子を受け継ぐ確率
-
flanking領域とは?
-
近親相姦(姉ー弟)
-
遺伝子名とタンパク質名の表記...
-
平安時代にも天然パーマの人っ...
-
モック感染細胞について
-
何故、B型はO型より少ないので...
-
一遺伝子一酵素説について
-
なんで兄弟は同じ親から生まれ...
おすすめ情報