DNAのPCRをおこなった後、電気泳動をした結果から
DNAサイズを求めたいのですが、検量線をどうやって
作ったら良いのかわかりません。
エクセルか何かでつくれるのでしょうか?

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A 回答 (1件)

ここを参考にしたらどうかと・・・


MACですがWINDOWSでもほぼ同様です。

参考URL:http://wwwyaku.meijo-u.ac.jp/chem_pharm/mhiramt/ …
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QSDS-ゲル電気泳動

SDS-ゲル電気泳動で、サンプル試薬をウェルにアプライするのですが、このサンプル溶液にグリセロールが入っていると実験書に書いてありました。
これは試薬をアプライしたときに試薬が拡散せずに下に落ちていくのに関係しているらしいのですが、これは何故なのか詳しく教えてください。お願いします。

Aベストアンサー

sarurujiさんこんにちは。
簡単に言うと比重の問題です。
SDSでもアガロースでも電気泳動の際にはゲルを泳動用のbuffer中に浸した状態で流しますね。

その際ウエルが解放状態にありますので、当然アプライしたサンプルはbuffer中に
拡散しようとします。グリセロールはこれを防いでくれます。

グリセロール以外にシュクロースなどを用いたりもしますが、用は糖を高濃度で加えて
比重を重くしているわけです。

しかし、サンプルが20とか30とかになると、アプライしている最中に僅かながら拡散が始まったり、
ゲルに浸透し始めてしまうので、大量のサンプルを扱うときはパラフィルムなどの疎水シート上で
グリセロールや泳動用色素とサンプルをミックスして並べてから一気にアプライします。(既にやってるかもしれませんが)

QHPLCでの検量線について検量線とは

HPLCで濃度の測定をしているのですが、月に1回検量線を引いています。(HPLCに標準液を流して)
この検量線なぜ引かなくてはいけないのでしょうか?
どなたか詳しい方いらっしゃいましたら簡単に説明願えないでしょうか。

Aベストアンサー

なぜ引かなければならないか.
検量線なしで,ピーク面積と濃度なり注入物質量なりの関係を知るにはどうしたらいいでしょうか?
これは吸光係数と光路長と送液条件がわかれば本来は予測できるわけですが,その計算をするのと検量線を引くのとは手間的に大差ありません.吸光係数を求めるのに,検量線を求めるのと同じような手数がかかるからです.

なぜ毎月測り直すのかという問題もあります.
これは最初の問題とも関係しますが,液クロのような分析では回収率というのが問題になるからです.つまり,入れた試料がカラムから完全に溶出してくるかどうかはわからず,条件によっては9割とか8割とかしか出てこないことがふつうにおこるのです.そして,回収率というのはカラム等を使い続けると,多くの場合は変化してきます.下がることが多いですが,上がることだってあります.これはつまり,ピーク面積が理論値と一致せず,しかも使っていくうちに変動する可能性をもっているということです.
ということで,手っ取り早いのはときどき(頻度はケースバイケース)検量線を引き直すということになるのでしょう.

なぜ引かなければならないか.
検量線なしで,ピーク面積と濃度なり注入物質量なりの関係を知るにはどうしたらいいでしょうか?
これは吸光係数と光路長と送液条件がわかれば本来は予測できるわけですが,その計算をするのと検量線を引くのとは手間的に大差ありません.吸光係数を求めるのに,検量線を求めるのと同じような手数がかかるからです.

なぜ毎月測り直すのかという問題もあります.
これは最初の問題とも関係しますが,液クロのような分析では回収率というのが問題になるからです.つまり,入れた...続きを読む

Q電気泳動のゲル

電気泳動の基礎的なことですが,質問させてください.
単純に考えると,電気泳動は電荷を持った粒子に電界中において移動させるものと思っております.このとき粒子が電気泳動する媒体(アクリルアミドゲルなど)は絶縁体なんですか?それとも導体とか電解質とかなんですか?
キャピラリー電気泳動なんかで,もしゲルが絶縁体だったら,キャピラリーがくねくねしていると電界が掛からないだろうし,導体だったら電流が流れてしまうし,電解質だったらゲル自体が電気泳動してしまうんじゃないかと思いました.
よろしくお願いします.

Aベストアンサー

ゲル担体は電気的に中性と考えてよいです。
ゲルを満たしているバッファーは電導性です。

ゲル担体は「ふるい(篩)」として働きます。電荷によって移動する物質を、ふるいの通り抜けやすさで分離しているのです。分子量が大きいほどふるいの網目を通り抜けにくくなり、立体構造が網目に引っかかりやすいほど通り抜けにくくなります。

核酸の電気泳動、タンパク質のSDS-PAGEでは、分子量と電荷が比例するので、ゲル担体(ふるい)がなければ分子量にかかわらず同じ速度で移動します。
ゲルというふるいがあり、分子量が大きいほど通り抜けにくくなるので、分子量に応じた分離ができるわけです。

Q相関係数と検量線の求め方と使い方

相関係数と検量線の求め方がわからなくて困っています・・・。

釘試料0.5gを酸で溶解し、生成したマンガンイオンを酸化させ過マンガン酸イオンとして100cm^3に低要したものを吸光度測定すると0.276でした。
200μg・cm^-3 の過マンガン酸カリウム標準溶液を0,4,8cm^3とり、100cm^3の酸に溶かし、この一部を1cmのセルに入れて吸光度を測定すると
0cm^3時:0.009、4cm^3時:0.335、8cm^3時0.674
この結果について相関分析と回帰分析を行い、濃度をXppm、吸光度をyとし相関係数と検量線を求めなさい。

という問題です・・・。
過去ログを探して似たような問題をみましたが、検量線、相関係数がよくわかりません・・・。自分の未熟のせいもあるのですが、どうか教えてください。

Aベストアンサー

検量線ためには、まず散布図を描きます。散布図の横軸は、標準液の濃度です。
 200ppmのものから、0m採ったものの濃度は、0ppmです。4ml採ったときの濃度は、原文のままなら、7.69ppm。8mlの場合は、14.8ppmになります。そのときの吸光度が、0.009、0.335、0.674ですね。
 エクセルのA列にX軸の数値になる濃度を、B列にその吸光度を入力します。すなわち、A1番地に0、A2に7.69、A3に14.8を入力します。B1に0.009、B2に0.335、B3に0.674を入力します。

 あとは、グラフから散布図を選んで描いて下さい。散布図における回帰式が、検量線になります。
 すなわち、グラフのウィンドをクリック>メニューバのグラフ>近似曲線の追加>種類(ここで、高次式を選ぶことも可能)、を確認後、オプションのタグ>グラフに数式を表示する、と、グラフにR-2乗値を表示する、のボックスにチェックをいれれば、グラフ上に回帰式と決定係数が表示されます。

 このやり方だと、y=0.0449+0.0028 (r^2=0.9989)になりました。fox19jpさんとほぼ同じ値ですので。おそらく正しく計算なさっていると想います。
 相関係数は、0.9989の平方根を計算すればOKです。

 あとは、サンプルの吸光度が0.276ですから、y軸の0.276から右に直線を水平に引き、検量線の交点からは、垂直に線をおろして、x軸の交点を読めば、6ppmほどの値がよめます。
 yに0.276を代入して、xを求めると、より正確ですが。

 あとは、5gのサンプル中のマンガンイオンは、100mlの溶液に全て移り、その濃度は約6ppmなのですから、釈迦に説法でしょう。

 厳密には、fox19jpさんの補足にある
r=√Σ(Xi-Xの平均)^2 / Σ(Yi-Yの平均)^2
m=(ΣXi-Xの平均)y / Σ(Xi-Xの平均)^2
Yi-Yの平均=m(Xi-Xの平均)
 から計算した値と、エクセルの散布図の検量線として扱った回帰式とは、一致しません。
 前者は、最小2乗法で計算し、エクセルのグラフは回帰だからです。

 現実的には、その差は無視できるくらいなので、実用上は問題ありません。

 文字で書くと、表現が貧弱で、分かって下さるかなと不安になり、イライラします。ご不明の点は、書き込んで下さい。

検量線ためには、まず散布図を描きます。散布図の横軸は、標準液の濃度です。
 200ppmのものから、0m採ったものの濃度は、0ppmです。4ml採ったときの濃度は、原文のままなら、7.69ppm。8mlの場合は、14.8ppmになります。そのときの吸光度が、0.009、0.335、0.674ですね。
 エクセルのA列にX軸の数値になる濃度を、B列にその吸光度を入力します。すなわち、A1番地に0、A2に7.69、A3に14.8を入力します。B1に0.009、B2に0.335、B3に0.674を入力します。

 あとは、グラフから散布図を選んで描いて下さい。散...続きを読む

Q電気泳動は何のためにするのでしょうか

米の品種判別実験でDNA抽出精製してからPCRをかけその後電気泳動するのですが、PCRはDNAが複製するんですよね、コレをやり電気泳動をすることで何がわかるのでしょう、また電気泳動は何をするため使われるんでしょうか

Aベストアンサー

例えば、農薬Aに対して、それを分解することで耐性を持つ品種を作るとすると、その品種が農薬A分解酵素を作るようにしてやればいいですよね。
そこで具体的には、農薬A分解酵素をコードした遺伝子を組み込んでやります。

上で組み込まれた遺伝子が増幅するようにプライマーを作ってPCRをすれば、改良された品種ではその部分が増幅されます。これに対して、その他の品種では何も増幅されないか、あるいは非特異的な増幅が起こります。
よって、PCR産物を電気泳動したときに、ある決まった長さ(プライマーデザインからあらかじめ分かっている長さ)のPCR産物が確認できれば、農薬Aの耐性を持つように品種改良されていることが分かります。

Q濾紙電気泳動について

濾紙電気泳動をおこなうときに、pHはどのように関係してくるのですか?
また、pH6.0においてグルタミン酸、リシン、セリンの混合溶液の濾紙電気泳動を行うと各アミノ酸はどのように分離するのか、分かる方教えてください!!

Aベストアンサー

 では私は後半を。と言っても,edogawaranpo さんの回答で十分とも言えるんですが。

 edogawaranpo さんがお書きの様に,正(+)に帯電した分子は陰極(-)側へ移動し,負(-)に帯電した分子は陽極(+)側に移動します。もちろん,中性分子はどちらにも移動しません。

 ここで,アミノ酸には (+)H3N-CHR-COOH ⇔ (+)H3N-CHR-COO(-) ⇔ H2N-CHR-COO(-) の3種の状態が存在する事を思い出して下さい。この中のどの状態で存在するかは,溶液の pH で決ります。当然,酸性になるほど左の状態が多くなります。edogawaranpo さんがお書きの「等電点」では真ん中の状態で存在し,分子全体としては中性になり,等電点より酸性側では正(+)に帯電し,等電点より塩基性側では負(-)に帯電します。

 後は,「グルタミン酸、リシン、セリン」の等電点を生化学の教科書でお調べ下さい。

Q電気泳動でのバッファー選択

ふと思ったのですが、アガロースゲル電気泳動ではTAEを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動ではTBEを使うのはなぜなのでしょうか?

Aベストアンサー

文意からするとDNAの電気泳動のようなので以下のURLを参考にしてください。
緩衝溶液の種類によって分離能が変わってくるようです。一般的に2種類の緩衝剤を混合して緩衝溶液を調製すると2箇所のpH領域で緩衝能を持ちますが、TAEやTBEの場合、そのような理由では用いられてはおらず、pH調整用に酢酸やホウ酸を加えているのでしょうね。

参考URL:http://bio.takara.co.jp/catalog/qa.asp?ID=53

Qイオンクロマトの次に電気泳動

ある化学メーカーの分析をされている方が、「イオンクロマトは変なものを打ち込めないので使いにくい」「イオンクロマトをもっていて、次に電気泳動を買うということが多い」といわれていましたが、どうしてですか?

簡単に理由を教えていただけますでしょうか。

Aベストアンサー

イオンクロマトは、割と精密な機械です。
試料を通す部分も、細いチューブやら、カラムやらを通るので
変なものを通してしまっても、そうそう掃除も出来ません。

対して、電気泳動は割りと単純な構成です。
試料を通す部分は一部使い捨てですし、本体もイオンクロマトと
比べて洗い易いです。

ただ、電気泳動はあまり精密な測定には向いていませんので、
どちらが良いかは、用途しだいかと思います。

Q電気泳動の正確さ

電気泳動のことで質問なのですが、電気泳動はどれくらい正確に測ることができるのでしょうか。教えてください。

Aベストアンサー

ゲルの状態(濃度・均一性)によって若干ずれたりしますので、
精度はその時々によって異なる…というのが実感です。

また、ゲルの端と中央で温度差が生じると、サンプルの移動に影響があります(「スマイル」と言われていて、「( 」←こんな感じになります。)
誤差を防ぐためには
・ゆっくりと(50Vで)サンプルを流す、
・両端のレーンはできるならば使わない ほうが良いみたいですね。

Q電気泳動で流しすぎるとどうなる?

2/3くらいまで流れたら止めることに
なっていますが、
電気泳動で流しすぎるとどうなるのですか?
バンドが見えなくなるのですか。

Aベストアンサー

DNAを電気泳動すると、
それぞれのDNA断片の長さ(場合によっては構造)に応じて異なる移動度で移動していきます。
目的のバンドがアガロースゲルの先端部分を越えると、
ゲルから出てしまい、
バッファー内で拡散してしまうために、
検出されなくなります。
(対流などが無ければそのまま陰極に向かっていくかもしれません)


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