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先日、実験でDNAの電気泳動を行いました。
それで、電気泳動の結果からDNAの分子量を求めなくてはならないのですが、いまいちよく分かりません。

電気泳動をしたのは標準マーカーと制限酵素処理する前のDNA、した後のDNAです。
標準マーカーはバンドが23、9.5、6.5、2.3、2.0に現れました。
制限酵素処理前のDNAはバンドが9.5に現れました。(した後については事情により省略させてください。)また、単位はKbpです。
自分でも考えてみたのですが、DNAの長さが分かっただけで分子量がどのように得られるのかさっぱり分かりません。
この結果からどのように分子量を求めていけばよいのでしょうか?
どなたかご教授願えませんでしょうか。よろしくお願いいたします。

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A 回答 (3件)

制限酵素処理する前のDNAはlinear DNAですか?plasmidだと制限酵素処理前だと環状をしていますので、正確なDNAの長さがでません。

オープンサーキュラーとクローズドサーキュラーというやつです。制限処理をした後のバンドの長さの合計でDNAの全長を算出し、それに660をかければOKです。
ちなみにx660というのはbase pairtあたり660ということで、塩基base (A T G C)の平均分子量がだいたい330ということからの概算です。
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この回答へのお礼

お答えありがとうございます。
あと、お礼が遅くなってしまい申し訳ありませんでした。
処理前のDNAはlinear DNAでしたから大丈夫でした。
おかげで何とか分子量が求められました。
また、なぜ660を掛けるのかも教えていただき本当にありがとうございました。

お礼日時:2006/10/19 18:41

1)泳動したサンプル量(g数)が既知ならバンドの位置からモル数がわかります



2)分子量マーカーの中には 既知の物を制限酵素処理したものがあります
23+9.5+6.5+2.3+2.0=43.3kbpの標準品を酵素処理したものではないでしょうか? 各バンドの分子数は同じですよね
9.5のバンドとご自分のサンプルのバンドの濃さでおおよその見当をつけてください
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この回答へのお礼

ご回答ありがとうございます。
あと、お礼が遅くなってしまい申し訳ありませんでした。
しかし、何とか分子量を求めることが出来ました。
本当にありがとうございました。

お礼日時:2006/10/19 18:36

正しいかどうかは、分かりませんが自分は以下の方法を用いています。


まず酵素処理した後のバンドの位置とマーカーの位置から、ベクター及びinsertの長さ(bp)が分かるはずです。また、1bp当たりの平均分子量(自分は自動的に660としていますが)を用いると自ずと分子量が分かることにんなります。
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この回答へのお礼

お答えありがとうございます。
あと、お礼が遅くなってしまい申し訳ありませんでした。
ご回答を読み、何とか分子量を算出することができました。どうもありがとうございました。

お礼日時:2006/10/19 18:33

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まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲルの「網目」を通過させる(大きいサイズほど流れにくく、小さいサイズのタンパク質は流れやすい)
というものです。網目を通過しやすいかしにくいかでタンパク質の長さを測定します。結果として、ゲルの下の方には小さいタンパク質が、上の方には大きいタンパク質がきます。

SDSで変性させる理由ですが、タンパク質を直鎖状にすることです。タンパク質はその機能を発揮するために特有の立体構造(疎水結合やジスルフィド結合などを利用して)を形成します。タンパク質をそのまま泳動すると、ポリアクリルアミドゲルの「網目の通りやすさ」はタンパク質の長さだけに影響されず、タンパク質の形状(立体構造)にも影響を受けます。

SDS-PAGEを行う場合の多くは、タンパク質の長さだけを知りたいので、タンパク質の立体構造に影響される電気泳動は望ましくありません。そこで、SDSでタンパク質を直鎖状にして電気泳動します。

では、SDSをいれるとなぜ、タンパク質が直鎖状になるか、です。SDSは親水基と疎水基の両方をもつ化合物です。そして、その親水基は負(マイナス)に荷電しています。

タンパク質の立体構造はアミノ酸残基(アラニン、グリシン、リジン、トリプトファン・・・)の性質(特にアミノ酸残基がもつ電荷)の影響を大きく受けます。SDSがタンパク質に作用すると、SDSの疎水基側がタンパク質に親水基側が溶媒側に結合します。このタンパク質に結合したSDSの親水基(マイナスに荷電)がタンパク質を構成する様々なアミノ酸の特性を打ち消してしまいます。結果として、SDSが結合したタンパク質はアミノ酸残基の影響をうけられなくなり直鎖状になります。

また、このようにSDSが結合したタンパク質はマイナスに荷電しますので、電気泳動をするとタンパク質(とSDSの複合体)はマイナスからプラスの方へ泳動されていきます。

最後に、立体構造に大きな影響を与えるジスルフィド結合に関してです。このジスルフィド結合はSDSによって壊されません。そこで、多くのSDS-PAGEを行う場合は、SDSと共に2-mercaptoethanolやDTTといったジスルフィド結合を壊す還元剤で処理したタンパク質を電気泳動します。

なお、立体構造も含めて解析したい場合は、Native PAGEと呼ばれる方法で電気泳動を行います。

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

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Q電気泳動写真からの濃度の求め方

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なのでサンプルと同じ濃さのMARKER2のバンドを探して、
そのバンドのDNA量を調べて求めます。
同じ濃さのものが無ければどのバンドと、どのバンドの間の濃さであるか見て概算します。

スキャナで取り込んでバンドの濃さを調べても出来ると思いますが、目で見て判断したほうが早いです。

マーカーのバンドの濃さの上限下限を超えている場合はDNAの濃さを概算することは難しいと思います。


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