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RNAの電気泳動について

初歩的な質問で申し訳ありません。

最近、動物細胞からtotal RNAを抽出する実験を始めました。
抽出後、電気泳動でチェックを行っています。
泳動後は、28S rRNAと18S rRNAのバンドを確認し、
実験が成功しているか判断する・・・というところまで調べたのですが、
28Sと18Sはおおよそ何bp付近にバンドが現れるものなのでしょうか。

現段階では、バンドは1500 bp付近に濃くと700 bp付近に現れています。
また、2000 bpの上あたりにも薄くバンドが現れています。
28Sと18S rRNAの質量比が約2:1ということなので、
1500 bp付近と700 bp付近のバンドを確認すれば良いのかと
考えてはいるのですが・・・

同じような質問がすでにあったら申し訳ありません。
行き詰ってしまっています。

宜しくお願いします。

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A 回答 (2件)

そもそも、RNAは一本鎖ですので、


DNAマーカーのどの分子量のバンドと同じか?と言われると
実際に比較してみないとわからないです。

また、RNAの分子量は、RNAの電気泳動をホルムアミドやホルマリンを加えた変性条件でする場合と
普通のDNAを泳動する場合と同じ条件でする場合とでも異なります。

さて、質問者さんの文脈から察するに、
おそらく、抽出したRNAがちゃんとしたものか?(分解していないか?等)ということを
実験前に確認したいということと思われるので、そのことについてアドバイス致します。

http://www.funakoshi.co.jp/shiyaku/entry/856.php …

こちらのサイトの泳動像をご覧下さい。
total RNAを泳動した場合、ほとんど2本しかバンドとして確認することができません。
(泳動像の分子量が小さいところにうっすらバンドが見える場合も、その場合3本)

そのメインの2本が28S rRNAと18S rRNAです。

なので、そのメインに見える2本がきちんとバンドとして確認されれば(ほぼ2対1になるのはおっしゃる通り)、
そのRNAはちゃんと精製できていると判断していいと思います。
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この回答へのお礼

お返事が遅くなってしまい、申し訳ありません。
大変わかりやすい説明、ありがとうございました。
その後も色々調べてみました。
勉強不足を痛感し、お恥ずかしい限りです・・・

他に回答して下さった方も、どうもありがとうございました。

お礼日時:2010/08/23 14:46

分子生物学の研究をするのであれば,それ位はデータベースなどから調べられないとまずいですよ。



28S は約 5000 bp,18S は約 2000 bp だそうです。
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QRNAの電気泳動

RNAの電気泳動についての質問です。
RNAをin vitroで作成し、できたRNAが目的の長さのものかどうか、スメアとなっていないか確かめるために行っています。マニュアルどおり(アガロースホルムアミド、サンプルにエチブロを混合)にやっているのですが、なかなかバンドが出てくれません。

(1)1レーンあたりサンプルRNAを2μg(吸光度より)流しているのですが、バンドが見えません。RNAだとDNAに比べてバンドが出にくいとかあるのでしょうか?5μg流したところでやっとバンドらしきものが見えました。
(2)さらに市販のRNAマーカーもバンドが出ません。マニュアルどおり1レーンあたり2μl使ってもバンドがなく、10μl使っても同様に見えませんでした。なにが悪いのでしょうか?RNaseには気をつけているつもりなのですが・・。マーカーが出ず、サンプルのサイズが不明なままなのです。なにか良い方法はないでしょうか?

DNAをメインに扱っていたもので疎い部分もありますが、よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

>マニュアルどおり(アガロースホルムアミド、サンプルにエチブロを混合)にやっているのですが、なかなかバンドが出てくれません。

そういうマニュアルがあるのかしら。ホルムアミドではなくフォルムアルデヒドでは? EtBrを泳動バッファーとゲルに入れておくという方法はありますが、サンプルに混合というのもあまりスタンダードではないです。ErBrは核酸と逆方向に流れますから、泳動しているうちにどんどん離れていってしまいます。二本鎖だとインターカレートしたEtBrが多少は核酸といっしょに移動するでしょうが、変性状態のRNAではそれもほとんどないでしょう。

結論としては、泳動後のゲルをEtBr溶液中で染めるべきです。
検出感度は二本鎖(1バンド1ng前後)に比べ、RNAのような一本鎖では10倍くらい低いです。それもホルムアルデヒド存在下だとさらに低くなるので、場合によっては、ゲルを蒸留水などで何度か洗ってホルムアルデヒドを抜いてやる必要があります。

Q形質転換効率?の求め方

プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
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Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

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形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

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今大学で電気泳動を盛んにしているのですが、いまさらながら電気泳動の原理や、なぜしているのかなどがいまいちよくわかりません・・・バンドがでてきますが、何を表しているのかもいまいちです。。情けない限りなのですが、どなたか教えていただけるとありがたいです。染色体地図をかいてくるとういう課題もでているのですが、電気泳動の意味がよくわかっていない自分には手のつけようのない課題なのです。どうかお願いします。

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Q蛋白の分子量(kDa)を調べる方法

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教えてください。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるための指数表記のことですよ。
・よって、『2.43E-19』とは?
 2.43×1/(10の19乗)で、
 2.43×1/10000000000000000000となり、
 2.43×0.0000000000000000001だから、
 0.000000000000000000243という数値を意味します。

補足:
・E+数値は 10、100、1000 という大きい数を表します。
・E-数値は 0.1、0.01、0.001 という小さい数を表します。
・数学では『2.43×10』の次に、小さい数字で上に『19』と表示します。→http://ja.wikipedia.org/wiki/%E6%8C%87%E6%95%B0%E8%A1%A8%E8%A8%98
・最後に『回帰分析』とは何?下の『参考URL』をどうぞ。→『数学』カテゴリで質問してみては?

参考URL:http://ja.wikipedia.org/wiki/%E5%9B%9E%E5%B8%B0%E5%88%86%E6%9E%90

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるた...続きを読む

QRNA抽出について

私は長年タンパク質専門で研究を行ってきたため、分子生物学は学生時以来なので大変困っております。
ラットの凍結組織(肝臓)からRNA抽出を行いましたが、うまくいきません。とは言え、同時に10本行ったらうち4~5本はOK、4本行ったら2本OK、と言った具合でいくつかは成功します。
キットはQIAGENのRNeasyPlusを使用し、凍結組織20~30mgに対し抽出液を600μl入れてポリトロンでホモジナイズし、gDNA eliminatorカラムも使用しています。中に入っているプロトコル通りであることも確認しました。組織の保存状態は悪くないです。うんと古いというわけでもありません。
研究室の人間に聞いても満足な返事が返って来ないので、こちらで質問させていただきました。経験がある方、アドバイス宜しくお願い致します。

Aベストアンサー

質問者さんは組織の保存状態についてわざわざ言及されているので、
その点は問題ないとして書き込ませていただきます。

私の感覚ですが、RNA抽出の過程にはものすごく強いタンパク質変性剤を使用しますので、
そのタンパク質変性剤の存在下では、まずRNAが分解されることはありません。
しかし、最終的にはタンパク質変性剤が存在しない溶液にRNAは溶けている状態になるので、
そのときに、それまでに取り除けなかったRNaseの活性復活、
もしくはその最後の溶液にRNaseがコンタミしていると最悪の結果になります。

それで私だったらまず疑うのは、最終的に溶かす水です。
これには少量でもコンタミするとRNAは壊れてしまうと思います。
もしそれを確認するのであれば、既に抽出されたRNAを質問者さんが使っている水で溶かして37℃で30分くらいおいた後、
電気泳動するとわかると思います。
この方法で使われている試薬等をチェックすると犯人がわかるときがあります。
ですが、タンパク質変性剤に含まれている場合はわからないかもしれません。

次に疑うのは、組織の量です。
確かにキット等では上限が記されているとは思いますが、試薬に少量コンタミしたRNaseより、最も多くのRNaseは組織由来のものであると私は思います。
多すぎるRNaseは最終的に残る可能性を大きくしてしまうと思います。
ちょっと組織の量を控えめにしてみてはいかがでしょうか。

あと、質問者さんが取ったRNAを泳動した場合、失敗と思われるものは全く何も泳動していないように見えるのでしょうか?
それとも、これが分解産物だろうなぁというスメアっぽいのも見えないのでしょうか?
もし、スメアも何も見えないというのならば、抽出行程のかなり初期の段階で壊れているか、
単に回収がうまくいっていないためであると考えられます。

回収については実際見ていないので何ともいません。
しかし、初期の段階で分解されるというのならば、やはり試薬のRNaseのコンタミをチェックするのがはやいかもしれません。
RNAがとれたりとれなかったりするのは、RNaseのコンタミが、なんと言うか、
うまくいくかいかないかのギリギリのところをさまようようなコンタミ具合で、
うまい人はいけるけどそうでない人は時々壊れるといったことなのかもしれません。
後はもう1つは、うまくいっている人と質問者さんが同時に同じサンプルでやることですかねぇ・・・。

乱文にて失礼します。

質問者さんは組織の保存状態についてわざわざ言及されているので、
その点は問題ないとして書き込ませていただきます。

私の感覚ですが、RNA抽出の過程にはものすごく強いタンパク質変性剤を使用しますので、
そのタンパク質変性剤の存在下では、まずRNAが分解されることはありません。
しかし、最終的にはタンパク質変性剤が存在しない溶液にRNAは溶けている状態になるので、
そのときに、それまでに取り除けなかったRNaseの活性復活、
もしくはその最後の溶液にRNaseがコンタミしていると最悪の結果にな...続きを読む

QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
別に70%エタノールで洗浄して、もう一度70%エタノールで洗浄してもいいと思いますし、逆に両方とも100%エタノールでもいいのではないかと素人の私は思ってしまいます。
70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

Q電気泳動の失敗

はじめまして

電気泳動の失敗例を探しています。

自分のバンドが何故でなかったのか
調べてるのですが…
分子量マーカーはちゃんとでたので
ゲルの問題ではないと思います。

出たのは「靄」みたいなので…ーー;

実験は

アガルースゲルの大腸菌を制限酵素で切断
エチシウムブロマイドで色を着け(色ではありませんが)
UVで照射し撮影しました。

どなたがご存知の方
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

制限酵素のSTAR活性かもしれません。
STAR活性のある制限酵素(EcoRIなど)を過剰に加えたり、反応時間が長すぎたり(オーバーナイトなど)すると、認識部位以外でも切断が起こって、DNAが靄状(スメア)になります。
経験者。

QRT-PCRについて

RT-PCRの質問です。
RNAからcDNAに逆転写するときに、Randam Primerと
いうものがありますが、これってランダムにRNAに
くっつくのですよね?だからいろんな長さのcDNAが
できてしまうと思うのですが、Randam Primerを使っても
大丈夫でしょうか?Randam Primerの他に、オリゴdT Primer
というのもありますが、どっちが逆転写に良いのでしょうか?

あと、cDNAを増幅させるときのPCRで、遺伝子特異的な
プライマーを使おうと思うのですが、1つのサンプルに
センスとアンチセンスのプライマーを混ぜても大丈夫
なのでしょうか?あらかじめセンスとアンチセンスを
等量混ぜたプライマー液を作っといて、反応液に混ぜれば
良いのでしょうか?

Aベストアンサー

#3です。
オリゴdTはmRNAにつけられるpolyA tailに結合します。
mRNAが持っているものですので、効率よく全長のcDNAを作製するとき、つまりcDNAライブラリーなどに使用される他、cDNAの3'側にPCRのprimerが設計されている場合には、mRNA特異的ということもあってRT-PCRにも有効ですが、まえのかたも書かれていますが、cDNAの全長がながく、しかも5'よりにprimerのsetが設計されている場合には増幅効率に影響しますので注意してください。

primerのミックスは作製しておいて良いですが、凍結融解を繰り返す場合には分注しておいたほうがいいのと、合成したすべてのprimerをまぜうようなことはしないほうが無難です。ときどき、こんなprimerはRT-PCRにしかつかわないからといって調子に乗って全部まぜる愚か者がおりますが、片方のprimerがひつような場合など多々ありますので、一部小分けしてミックスして、さらに分注して保存しておくのは便利だと思います。


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