RNAの電気泳動についての質問です。
RNAをin vitroで作成し、できたRNAが目的の長さのものかどうか、スメアとなっていないか確かめるために行っています。マニュアルどおり(アガロースホルムアミド、サンプルにエチブロを混合)にやっているのですが、なかなかバンドが出てくれません。
(1)1レーンあたりサンプルRNAを2μg(吸光度より)流しているのですが、バンドが見えません。RNAだとDNAに比べてバンドが出にくいとかあるのでしょうか?5μg流したところでやっとバンドらしきものが見えました。
(2)さらに市販のRNAマーカーもバンドが出ません。マニュアルどおり1レーンあたり2μl使ってもバンドがなく、10μl使っても同様に見えませんでした。なにが悪いのでしょうか?RNaseには気をつけているつもりなのですが・・。マーカーが出ず、サンプルのサイズが不明なままなのです。なにか良い方法はないでしょうか?
DNAをメインに扱っていたもので疎い部分もありますが、よろしくお願い致します。
No.4
- 回答日時:
私の勉強不足でした。
変性RNAサンプルにEtBrを混ぜて電気泳動する方法は80年代から数々報告があり、Molecular Cloning 3版にも常法として載っているのですね。どうやらインターカレーションによるのではなく、アルデヒド存在下で核酸とEtBrがある種の化学反応を起こすことで結合するようですね。
文献によると1バンド10 ng程度のRNAがあれば検出できるそうですから、ご質問にある例でも本来十分検出できるはずですね。
ひょっとするとRNAとEtBrとの反応が不十分なのかもしれません。
RNA、フォルムアミド、フォルマリンを混ぜて加熱する段階でEtBrを入れておいたほうが、熱変性後にEtBrを加えるより感度が上がるという記載もあります。
ご参考まで。
なるほど、勉強になります。EtBrはRNAサンプル加熱後に入れていました。もしかしたらこれが原因かもしれません。ありがとうございました。
No.3
- 回答日時:
2の方が指摘されているようにアガロースホルムアミドというのが良く分かりませんが、一般的なホルムアルデヒドアガロースでMOPSバッファーでRNAを流した場合、ゲルにEtBrを入れたり、後染めをするより、サンプルにあらかじめ混ぜておいた方がはるかに強いシグナルが得られます。
あらかじめ混ぜておいた方がEtBrが効率よく核酸に結合するためと思われます。結合していないEtBrは反対方向に流れますが、すでにサンプルに結合したEtBrは泳動中にそんなに簡単には外れないので問題ありません。1,2の方が言われることは一般的によく言われることですが、私の経験では先染めの方がはるかにバンドははっきり見えます。それから、もしRNAのサイズが1Kb程度かそれ以下ならば変性PAGEで分離した方がバンドとしてはシャープにシグナルも強く見えます。私は転写したRNAは長さに応じて、3から8%のUrea変性PAGEで流して確認しています。PAGEならゲルも薄いですし、EtBrは後染めで1分程度で充分です。
ご回答ありがとうございます。あらかじめエチブロを入れておき、さらに後染めを行ったところ上手くいきました。なぜか、なぜか先染め(混合)だけではバンドが見えませんでした。RNAの量が少ないのでしょうか?普通はどのくらいの量を流せばみれるのでしょうか?
貴重なご意見ありがとうございました。
No.2ベストアンサー
- 回答日時:
>マニュアルどおり(アガロースホルムアミド、サンプルにエチブロを混合)にやっているのですが、なかなかバンドが出てくれません。
そういうマニュアルがあるのかしら。ホルムアミドではなくフォルムアルデヒドでは? EtBrを泳動バッファーとゲルに入れておくという方法はありますが、サンプルに混合というのもあまりスタンダードではないです。ErBrは核酸と逆方向に流れますから、泳動しているうちにどんどん離れていってしまいます。二本鎖だとインターカレートしたEtBrが多少は核酸といっしょに移動するでしょうが、変性状態のRNAではそれもほとんどないでしょう。
結論としては、泳動後のゲルをEtBr溶液中で染めるべきです。
検出感度は二本鎖(1バンド1ng前後)に比べ、RNAのような一本鎖では10倍くらい低いです。それもホルムアルデヒド存在下だとさらに低くなるので、場合によっては、ゲルを蒸留水などで何度か洗ってホルムアルデヒドを抜いてやる必要があります。
失礼致しました。ホルムアミドでなくホルムアルデヒドでした。
RNAが一本鎖であることが感度を低くしているのですね。
早速後染めを試してみたのですが、若干弱いながらもマーカーもサンプルもバンドを見ることができました。
ありがとうございました。大変助かりました。
お探しのQ&Aが見つからない時は、教えて!gooで質問しましょう!
似たような質問が見つかりました
- 生物学 mRNAとtRNAについて 1 2023/01/17 16:59
- 生物学 セントラルドグマの流れはこれであっていますでしょうか? DNAの遺伝情報がRNAポリメラーゼによって 2 2022/09/09 22:13
- 生物学 大腸菌とプラスミド 1 2022/07/04 01:40
- その他(病気・怪我・症状) 新型コロナワクチン接種後にクロイツフェルト・ヤコブ病が発症、確定した患者26人全員死亡したという論文 7 2022/06/09 04:07
- 医療・安全 新型コロナワクチンの問題は m-RNAが自然感染のものは2分程度で消滅しますがワクチン接種後のm-R 1 2023/07/11 04:33
- 医療・安全 新型コロナm-RNAワクチンにはこういう特徴があるらしいですがどう思いますか? 1 一定量の分解され 6 2023/07/25 09:18
- 医学 新型 コロナワクチン 今回のP社、M社のワクチンはRNAで、AZ社にいたってはDNAです。あなたの設 7 2022/09/15 23:40
- その他(悩み相談・人生相談) 私は小さい頃から音楽が好きで 女の子ならよく通る「アイドルになりたい!」から始まり 中学生ではギター 5 2023/04/18 21:49
- その他(ニュース・時事問題) 中国は、コロナの弱毒化の確認場&コロナ感染政策の実験場? 1 2022/12/28 23:55
- 楽器・演奏 バンドのライブの楽器以外の音はどこまで? 友人とバンドをやろうと思っています。 まだ強くは思ってない 1 2023/03/10 19:49
おすすめ情報
デイリーランキングこのカテゴリの人気デイリーQ&Aランキング
-
バンドの濃さから求めるDNAの量
-
電気泳動によりDNAの分子量を求...
-
制限酵素地図の作成
-
DNAの電気泳動法による長さの測定
-
電気泳動
-
DNA電気泳動で困ったことが起こ...
-
電気泳動写真からの濃度の求め方
-
プラスミドの泳動動距離
-
ImageJの使い方についてお教え...
-
Ligation
-
超遠心の方法
-
制限酵素地図の作成方法(すみま...
-
吸光度を用いたDNA濃度定量法に...
-
DNAの濃縮(イソ沈、エタ沈)がう...
-
segment と fragment
-
エチブロの処理
-
脂肪細胞 RNA 抽出
-
生物で、鳥の親子のDNA の読み...
-
期限切れのReady-to-useゲル
-
エチジウムブロマイドについて
マンスリーランキングこのカテゴリの人気マンスリーQ&Aランキング
おすすめ情報