『ボヘミアン・ラプソディ』はなぜ人々を魅了したのか >>

まったくの初心者なので・・・・・。
泳動後のゲルの染色についてお尋ねしたいのですが、
アガロースゲルでDNAを泳動した後、エチジウムブロマイドで染色しようと思っています。その時のエチジウムブロマイドの適当な濃度と染色時間を知りたいです。本によって濃度が 様々であり 困ってます。
誰か教えて下さい。宜しくお願いします。

A 回答 (3件)

kimwipeさんとdora1さんとほぼ同様です。

私は後染めですが、EtBrは10mg/mlで遮光室温でストックしており、水200mlに2mlを加えています。別に用事調整ではなく、何度か使いまわしています(捨てるのに手間がかかりますので)。5分程度シェーカーの上で置いて、その後数回水洗いです。写真を撮る場合、キムワイプ等で水気を切ってから撮っています。ただ、すぐに撮るとバックが強く出る感じがあるので、10分程度おいてから撮っています。ただし、置きすぎるとバンドがぼけます。kimwipeさんがおっしゃるとおり、ゲルにあらかじめEtBrを加えておくと、きれいにバンドが染まるし、泳動中にUVで確認できますが、EtBrが陰極か陽極側に(忘れました)寄るので、ゲルの濃度とバンドの位置によってはバンドとバックが重なるかもしれません。
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この回答へのお礼

ありがとうございます。10mg/mlの濃度にしたいと思います。また、写真を撮る際の アドバイスも参考にさせていただきます。

お礼日時:2002/11/24 21:03

まったくの初心者ということですので、そのつもりで書きます。

本によって濃度がまちまちな理由のうちのひとつは、エチブロの適正濃度の範囲が広いからだと思います。実際に、わたしは加えるエチブロの量は目分量です。また、仮にエチブロが濃すぎたとしたら(バンドは強く染まるがバンドのないところもうっすらと染まってしまうので見にくい)、そのゲルを水かバッファの中に数分入れておくと余分なエチブロが流れるので見やすくなりますし、薄すぎたとしたら(バンドが薄いので見にくい)溶液にエチブロを追加してもうちょっと染めてみるだけです。ですから、最初は、どれかの方法にしたがってやってみてください。最初に作ってみた濃度で染めた結果によって、濃度を変えてみればよいだけですから。(このての実験を今後続けていかれるのでしたら、こんな感じで「自分の実験の条件」を探していくのも重要なことになります。実験がうまくいかなかったときにどこが悪いのか自分で見つけて修正していかないといけないわけですし。だんだんと身についていきますよ。)
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この回答へのお礼

ありがとうございます。そうですね、これからは 自分での実験条件を 試行錯誤したいと思います。

お礼日時:2002/11/24 20:58

私は10mg/mlのエチブロをバッファー1000mlに対して10μl入れてます。


そして染色時間は15~20分くらいでしょうか。確かに本によってまちまちなので、私の濃度は濃いかもしれません。

というか私は後染めは殆どやりません。予めゲルにエチブロを入れておいた
ほうが写真が綺麗に取れるし、染色時間も無くて済みます。その時も10mg/mlのエチブロをゲル1000mlに対して10μl入れてます。
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この回答へのお礼

どうもありがとうございます。ゲルにエチブロを入れる方法も参考にしたいと思います。

お礼日時:2002/11/24 20:53

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DNAのアガロースゲル電気泳動では、一般に、その泳動用緩衝液とゲルにエチジウムブロマイドが含まれているらしいのですが、私は泳動後にエチジウムブロマイド溶液で染色するだけで、緩衝液にもゲルにもエチジウムブロマイドを加えたことがありません。緩衝液やゲルに加えるのには染色以外の目的があるのでしょうか?教えてください!

Aベストアンサー

(1)あらかじめエチブロを緩衝液に入れておく
(2)エチブロをゲルに入れておく
(3)泳動後にエチブロ染色
の3つの方法についてですが、目的は同じです。
ご存知の通り、DNAの染色ですね。
では、なぜこの3通りの方法が使われているかですが…。

(1)、(2)は(3)の方法と比べて、染色工程分だけ作業時間が短縮できます(泳動と同時に染色しているわけですので)。さらに(2)では発ガン性物質であるエチブロが取り扱いしやすくなっています。
それでは(1)、(2)の方が(3)より優れた方法なのか?と言うとそうではありません。(3)のメリットは泳動後のバンドがきれいであるということです。
(1)、(2)の電気泳動において、エチブロはDNAと反対の極に向かって流れていきます。泳動の過程でDNAには少しずつエチブロが付着していくわけです。つまり、(1)、(2)の方法では、全く同じサイズのDNAだけを電気泳動したとしても、エチブロの付くタイミングと付着量によって、その後の移動の速度に差が出てきてしまうため、少しですがバンドが広がってしまうのです(このバンドの広がりはほとんどの実験では問題にならない程度です)。

長くなったのでまとめます。
(1)あらかじめエチブロを緩衝液に入れておく
メリット:染色工程短縮。
デメリット:バンドがわずかに広がる。
(2)エチブロをゲルに入れておく
メリット:染色工程短縮。エチブロがゲル中なので扱いやすい。
デメリット:バンドがわずかに広がる。ゲルにエチブロを入れるときにエチブロが少し分解する(ゲルが固まる前の熱い中にエチブロを入れるので)。
(3)泳動後にエチブロ染色
メリット:バンドがきれい。
デメリット:染色時間が必要。

(1)あらかじめエチブロを緩衝液に入れておく
(2)エチブロをゲルに入れておく
(3)泳動後にエチブロ染色
の3つの方法についてですが、目的は同じです。
ご存知の通り、DNAの染色ですね。
では、なぜこの3通りの方法が使われているかですが…。

(1)、(2)は(3)の方法と比べて、染色工程分だけ作業時間が短縮できます(泳動と同時に染色しているわけですので)。さらに(2)では発ガン性物質であるエチブロが取り扱いしやすくなっています。
それでは(1)、(2)の方が(3)より優れた方法なのか?と言うとそうでは...続きを読む

Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
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よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

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エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

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Q電気泳動のスメアバンド

DNAを電気泳動をしたときに、バンドが一本ではなく、スメアになることがあると思います。スメアバンドは様々なサイズのDNAが存在するために、見かけ上スメアになると思っていたのですが、ほんとうのサイズより遥かに大きなサイズと思われるところまで、スメアなバンドが広がっていたりします。また、スメアなバンドをゲルから回収して再精製して泳動してみると、違ったサイズにでたりすることもあります。
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Aベストアンサー

エチジウムブロマイドは二本鎖の核酸において塩基間にもぐりこむように結合します。そのため、2本鎖のRNA・DNAが染色されます。そのほかにはゴミとかとも結合したりしますがスメア状にはならず、ぽつぽつとした点状に光ります。
PCRにはdNTP・プライマー・テンプレート(DNAとRNA)・DNAポリメラーゼ・bufferが含まれており、反応後になると上記の残留物に加えて増幅産物が含まれるようになります。
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エチジウムブロマイドは二本鎖の核酸において塩基間にもぐりこむように結合します。そのため、2本鎖のRNA・DNAが染色されます。そのほかにはゴミとかとも結合したりしますがスメア状にはならず、ぽつぽつとした点状に光ります。
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Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Q電気泳動の失敗

はじめまして

電気泳動の失敗例を探しています。

自分のバンドが何故でなかったのか
調べてるのですが…
分子量マーカーはちゃんとでたので
ゲルの問題ではないと思います。

出たのは「靄」みたいなので…ーー;

実験は

アガルースゲルの大腸菌を制限酵素で切断
エチシウムブロマイドで色を着け(色ではありませんが)
UVで照射し撮影しました。

どなたがご存知の方
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

制限酵素のSTAR活性かもしれません。
STAR活性のある制限酵素(EcoRIなど)を過剰に加えたり、反応時間が長すぎたり(オーバーナイトなど)すると、認識部位以外でも切断が起こって、DNAが靄状(スメア)になります。
経験者。

Q電気泳動でバンドが出ない理由(学生実験)

Transformationした大腸菌のプラスミドを抽出して、アガロースゲル電気泳動にかけてLigationなどがうまく行っているかどうかを確かめました。

大腸菌のコロニーに
TE/RNaseA

NaOH(アルカリ変性させた)

NaOAc(中性に戻した 大腸菌のゲノム:ニックが入ってもとに戻らない、プラスミド:元に戻る)

phenol/chlorophorm(ph層:大腸菌のゲノム  水層:プラスミドをふくむ)

水層をとりだしてisopropannol加える

ethanol(洗浄)
の順で操作を行った後、電気泳動しました。

しかし、私がやったサンプルはバンドがだいぶ薄くなってしいました。
その理由がわからず悩んでおります。

予想としては、phenol/chlorophormをいれて遠心をかけて油層と水層にわけたときに、二つの層の間に白い層(タンパク質が含まれているらしい層)があり、水層(プラスミド含)を取り出す際にそれをピペットで吸ってしまったことが原因だったのかな、と思っているのですが、その根拠などもわかりません。

どなたかわかる方がいらっしゃいましたら、教えてくださると幸いです。

Transformationした大腸菌のプラスミドを抽出して、アガロースゲル電気泳動にかけてLigationなどがうまく行っているかどうかを確かめました。

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TE/RNaseA

NaOH(アルカリ変性させた)

NaOAc(中性に戻した 大腸菌のゲノム:ニックが入ってもとに戻らない、プラスミド:元に戻る)

phenol/chlorophorm(ph層:大腸菌のゲノム  水層:プラスミドをふくむ)

水層をとりだしてisopropannol加える

ethanol(洗浄)
の順で操作を行った後、電気泳動しました。

しかし...続きを読む

Aベストアンサー

バンドが薄くても検出されてるなら、学生実験ならまぁOKではないでしょうか。

 原因としては、エタノール沈澱洗浄の際、プラスミドまで吸ってしまったり、あるいはもともとサンプルに極端にプラスミドが少なかったりしたこと、あるいは上清分離の際にプラスミドあるいはゲノムの層を取る量が少なかったなどが挙げられるのではないでしょうか。

 あるいは電気泳動の際に、希釈でミスしてたりも考えられます。

 ご検証ください。

 

QPCR後の遺伝子の安定性について教えてください。

最近、研究室の友人がPCR後の増幅された遺伝子のサンプルを翌日、翌々日に電気泳動させています。
PCR後の遺伝子は凍結保存してどのくらい持つのでしょうか?お願いします。

Aベストアンサー

核酸は字のごとく酸です。
従って、水のなかで長期保存した場合、分解します。
長期保存する場合は、緩衝液(TE)などに保存することが必要です。
特にプライマーはTE中に保存しないと数年後に同じ条件でPCRが掛からないなってことが起こります。
分解が起こる他の条件としては
凍結融解もあります。
凍結融解を繰り返すと確実にDNAは壊れます。

理由はわかりませんが、経験上濃度の薄いDNAほど分解しやすいようです。

Qアンピシリンの失活温度について

アンピシリンの失活温度について教えてください。

LB(Amp)のプレート培地を作製する時にいつも思うことです。

オートクレーブ後の三角フラスコに入っているLB培地に、いつアンピシリンを添加すればいいのかわかりません。

僕の場合は、三角フラスコをクリーンベンチ内で両手で触って円を描くように揺らしてみて、手をつけてられる熱さまで冷ましてから入れるようにしています。

宜しくお願いします。

Aベストアンサー

私も学部生の頃に同じことを考えましたが。。。結論は結構微妙なところだと思います。アンピシリンは酵素のように高温になると変成していっぺんに失活する訳ではなく、高温になるほど分解の進みが早くなるわけですよね。(もちろん1時間くらい煮沸すればかなり失活するかもしれませんが。。)。というわけで、結局実験的にできるだけ影響が起きない(しかし、ゲルが固まらない)ような妥協点の温度でやるために手で触れる=約60℃で添加することがスタンダードになってるわけです。

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルム...続きを読む

Qプライマーの希釈について

これからPCRを行う初心者です。
プライマーを合成してもらい、乾燥状態で届きました。
まずこのプライマーを100μMの濃度にするように言われました。添付文書に27nmolとあったので270μlの水で溶かせばいいのでしょうか?
PCRには0.2mMで使用したいのですが、100μMにした後、どのように希釈してよいのかわかりません。
計算がわからないので教えてください。
よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

>添付文書に27nmolとあったので270μlの水で溶かせばいいのでしょうか?

正解です。100 μMは100 pmol/μLです。27 nmol=27000 pmolなので、270 μLに溶かせばよいです。

>PCRには0.2mMで使用したいのですが、100μMにした後、どのように希釈してよいのかわかりません。

0.2mMは200 μMです。100 μMの濃度の倍ですから希釈ではできません。
なにより、0.2 mMは濃すぎます。勘違いでは?

プライマーは薄めすぎると分解しやすいので100 μMでストックするとして、当座使う分は10倍に薄めて10 μM (10 pmol/μL)にしておきます。これをPCR反応50 μLあたり1.0~2.5 μL(終濃度0.2~0.5 μM)使うくらいが相場だと思いますが。


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