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PCR産物（2.5kb）の確認のためにアガロースゲル電気泳動を行っています。しかし、サンプルがウェルにスタックしてしまって、うまく流れてきません。マーカーはきれいに流れています。マグネシウム濃度を振ってPCRをしたのですが、マグネシウム濃度が高いサンプルほどウェルの付近ははっきりと光っているので、実はPCRはうまくいっているのではないかと考えています。どうやったらきれいに流すことができるのか教えてください。また、PCR産物をPCR-purification kitなどで精製して流すと改善されたりするのでしょうか？
No.5ベストアンサー
- 回答日時：
おそらくPCRのかけすぎ（テンプレート量やサイクル数が過剰）。
PCR産物がある程度増えた状態で、さらにサイクルを続けると、産物同士のミスアニールから伸長してどんどん長い産物ができます。ひどいときはお書きになったようにウェルにスタックするほど巨大化します。
Mgが多い方が増幅しやすい（反面ノンスペもでやすい）ので、Mg濃度の高い方がはっきり見えたんでしょう。
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テンプレート量は20ngだったのですが、サイクル数が36サイクルで過剰だったかもしれません。サイクル数を減らして再度トライしてみます。
Mgが多い方がノンスペもでやすいのですね。気をつけてみてみます。
どうもありがとうございました。
No.4
- 回答日時：
ゲルの％
泳動に使っているバッファー
PCR反応に使っているバッファー
泳動時にアプライしたPCR産物の溶液はどうなっているのか
（PCR反応後、その反応液の一部をそのまま流したとか）
を書いた方がいいと思います。
ちなみに私は
ゲル１～２％（分子量に応じて、2.5kbpだったら１％）
1×TAEや1×TBE
PCR反応はTAKARAやTOYOBOとかいろいろ
反応液をそのまま10μlほどにローディングバッファーいれて泳動
です。
まず、質問者様のようになったことはありません。
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泳動条件は１％で、1xTBE、PCR反応液8μLにローディングバッファーを2μL入れています。やはりPCRがうまくいってないようですね。
ご丁寧にありがとうございます。
No.3
- 回答日時：
まず、マーカーというのは分子量マーカーのことを言っているのか色素マーカーのことを言っているのかどちらですか？
あと、ＵＶとかで濃度は測りましたか？
まあ、高塩か何かで粘度が高かったりすると流れないこともありますね。他には、ＤＮＡ濃度が高すぎるとか
あとはまさかですが、目的物よりはるかに大きいＰＣＲ産物が生成しているとかでしょうか
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マーカーは分子量マーカーです。
UVで濃度は測ってませんが、白い沈殿物のようなものがPCR後に生成していたので、おそらく目的物よりはるかに大きい産物ができている可能性がありそうです。どうもありがとうございます。
No.1
- 回答日時：
あくまで質問者様が、マグネシウムが原因と思いなら（私にはそれが原因であったとしても理由はわかりませんが）、
エタノール沈澱してバッファーを交換してみてはいかがでしょうか？
ついでにフェノクロもやっちゃったらどうでしょうか。
この回答への補足
質問の仕方が悪くてすいません。マグネシウムが原因と考えているわけではなく、マグネシウム濃度に依存してtotal DNAの量が変化しているように見えるので、何らかのDNAの量はPCRによって増えていそうだと考えただけです。PCR産物をPurification kit で精製して泳動してみたのですが、結果は同じでした。ウェル付近でスメア状になっていてバンドは見えません。やはりこれはPCRを失敗しているのでしょうか？
補足日時：2009/01/30 04:17-
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