A 回答 (3件)
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No.3
- 回答日時:
>かなり離れた施設のためレーザーの波長はすぐには確認できませんが、マニュアルに従い自分で設定した項目はLASER SPOT SIZE: 30 um,POWER: 25-35mW,DURATION: 5-6 msでした。
自分で設定しないで、メーカーに必ず行くはずのお勧めの条件を教えてもらいましょう。
>コントロールは取りましたが、必ず行くはずの切片およびレーザーを当てたPositive controlでPCRがかからず、PCR全体が失敗しているような状態です(もちろんPCRのポジコンDNAはちゃんと増幅されています)。同じブロックのパラフィン切片から抽出したDNAはPCRがかかり、レーザーキャプチャーの工程を経るとバンドが出なくなってしまいます。
もちろん、ダメなときも、同じブロックのパラフィン切片から抽出したDNAはPCRがかかることは、同時にランしてチェックしていますよね??? その同じブロックのパラフィン切片に、その抽出キットを適用することは可能ですか?それで抽出キットがワークしているかどうか分かりますよね?
>また、A260/280の比が約0.9というのも気になります。おそらく抽出の際のProtease K(熱変性済み)がサンプルに混入しているので280の値が高く出ているのだと思うのですが、DNA抽出キットのプロトコールによると、95℃10分でProtease Kを失活させたら、ダイレクトにPCRサンプルとして使えると書いてありました。
さらに、Protease をしっかつさせる操作がいるかもしれません。フェノールやProtease 阻害剤など。
No.2
- 回答日時:
レーザーの波長が書いていないので、分かりません。
レーザーが超波長のUVに属するのなら、DNAは多少壊れるでしょう。>取っている場所は大丈夫だと思います。
これもコントロールを取りましたか? 違う場所のコントロール、必ず行くはずの切片のコントロール。
レーザーを当てたPositive Controlも取ります。
>パラフィン切片からDNAを抽出した場合はけっこううまくPCRがかかっていたのですが、
もちろんそのDNAは他のうまくいかない実験でランしてますよね。
この回答への補足
かなり離れた施設のためレーザーの波長はすぐには確認できませんが、マニュアルに従い自分で設定した項目はLASER SPOT SIZE: 30 um,POWER: 25-35mW,DURATION: 5-6 msでした。
コントロールは取りましたが、必ず行くはずの切片およびレーザーを当てたPositive controlでPCRがかからず、PCR全体が失敗しているような状態です(もちろんPCRのポジコンDNAはちゃんと増幅されています)。同じブロックのパラフィン切片から抽出したDNAはPCRがかかり、レーザーキャプチャーの工程を経るとバンドが出なくなってしまいます。
DNA抽出はLCM用のDNA抽出キットで行い、約50 ng/uLの濃度で取れているのですが、これだけあればLCMのサンプルで十分PCRはかかるものでしょうか。
また、A260/280の比が約0.9というのも気になります。おそらく抽出の際のProtease K(熱変性済み)がサンプルに混入しているので280の値が高く出ているのだと思うのですが、DNA抽出キットのプロトコールによると、95℃10分でProtease Kを失活させたら、ダイレクトにPCRサンプルとして使えると書いてありました。
初心者のため、つたない説明で申し訳ありません。。。
No.1
- 回答日時:
Positive Contolは考えられる範囲でほぼ完璧に取っていますか?
レーザーを当てたPositive Contolがあればさらに良いと思いますが。
この回答への補足
さっそくの回答ありがとうございます。
取っている場所は大丈夫だと思います。
パラフィン切片からDNAを抽出した場合はけっこううまくPCRがかかっていたのですが、より詳細な部位を特定してレーザーキャプチャーをしようとしてから殆ど増幅がみられなくなりました。
レーザーでDNAが劣化するというのはあるのでしょうか。機械は初期の古いタイプなのでそれも気になっています。
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