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大腸菌の形質転換の学生実験(lacZ遺伝子に挿入して、X‐galを含んだ培地で培養)で白色コロニーからプラスミドDNAを回収したんですが挿入DNA が入っていませんでした。この理由を教えてください。
また(薄い)青コロニーからプラスミドを回収したらDNA断片が挿入されていました。この理由も教えてください。

A 回答 (8件)

薄青コロニーの現象は、実際にクローニングをしているとよく遭遇する現象で、実験の「こつ」のひとつともいえる現象です。



本来は、DNA断片が挿入されると、lacZ遺伝子が破壊されて、白色コロニーになるはずです。しかし、場合によっては、下流まで転写が進み、不完全な状態、且つ微量ながら、LacZ蛋白質ができてしまうことがあります。そうすると、真っ白ではなく、薄い青になってしまいます。
(挿入断片中にプロモーター活性がある場合、短い挿入断片で、中に終止コドンが無い場合などに起こります)

ただ、白色コロニーに、挿入DNAが入っていないプラスミドが入っていたというのは、あまり無い話です。薄青コロニーが当たりだったときには、白色コロニーは、プラスミドそのものが入っていないことが多いです。これは、プラスミド上の薬剤耐性遺伝子ではなく、宿主そのものが変異して、薬剤耐性を持ってしまった場合に起こることです。

もし、挿入断片が入っていないプラスミドが回収できたとすると、ライゲーションまでの間にプラスミドの切断部分に削り込みが起こってしまっていて、フレームシフトなどの変異が起こってしまった可能性が高そうです。

ちなみに、プラスミド上のlacZ遺伝子は、lacZ遺伝子の全長ではなく、N末側の一部分だけがのっています。これが転写・翻訳されると、宿主が持っているN末を欠いたlacZ遺伝子の産物とくっつくことによって、活性を持ったLacZ蛋白質となります。(alpha-complementationといいます)
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この回答へのお礼

いろいろ教えていただきありがとうございます。
どう考察していいのか分からず助かりました。

お礼日時:2004/07/03 03:58

酵素がHind3ですか。


予想はしていましたが。。。
おそらく挿入断片はλHind3マーカーだと思います。
他の班の挿入断片の大きさは0.6kbや2kbとか2.3kbもしくは4.4kbではないですか?
もしそうであればマーカーにある0.1kb程の断片が入ることがあります。
これは見にくい断片ですし、ゲルの端から出てしまった可能性も否めません。BPBより速く流れますから。
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ベクター(プラスミド)、インサート(挿入断片)は、何の制限酵素で切りました?


ライゲーションのときの、両者の濃度比は?

ベクターの濃度がインサートに比べて多いと、ベクター同士がライゲーションしてしまい、白コロニーだけど、挿入断片らしきもののバンドが出ないってことになります。

まぁ、可能性ですけど。

この回答への補足

制限酵素はHind3 挿入断片:ベクター=2:1でした。

補足日時:2004/07/01 11:38
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ただX-galだけをプレートに巻き込んで、


そこにトランスフォーマントをまいただけでは
正確なカラーセレクションできませんよ。
リプレッサーとIPTGはご存知でしょうか?

この回答への補足

ご存知です。

補足日時:2004/07/01 11:40
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白コロニーから挿入断片のないプラスミドがとれたことについて



おそらく挿入断片が入っています。
ただ見えにくいだけです。
小さいからエチブロに薄く染まるので。
また、泳動するゲルの濃度がその大きさの断片の検出にあっていないのかもしれません。
小さすぎてBPBより速く流れてゲルの下端からゲル外に出たのかも。
多分ですが100ベース~200ベースくらいのものだと思います。
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あまり遺伝子実験には詳しくないのですが、この実験はちょっとやったことがあるので、ご回答しようと思います。



白いコロニーから挿入したはずのDNAが確認できないのは、プラスミドDNAの回収やその後の操作でDNaseのコンタミが起こったのではないかと思います。学生実験ということですので、他の学生の結果がどうだったか聞いてみてはいかがでしょうか?おそらく白いコロニーからは目的のDNAが検出されているはずです。もし全員が全滅しているようであれば、実験の指導が悪いということですね(笑)

薄い青コロニーから断片が挿入されている、というのは、この実験の考察の肝になるところなので、あえてお答えしません。要は実験では教科書にあるとおりの理論だけの現象は起こらないということです。
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学生実習でこんな実験するとも思えませんけど・・・。


学生の推理力を試しているのかな?
そういえば、私が受けた実習の中にはわざとベクターをコンタミさせて、学生の混乱を招く学生実習もありましたし。

普通に考えると逆ですよね。
でも結果から考えたら?
・白コロニー・・・lacZ遺伝子が働いてない。DNAなし。
・青コロニー・・・lacZ遺伝子が働いている。DNAあり。
白コロニーはlacZ遺伝子が働いていないので、遺伝子がない、もしくは破壊された。
DNAが入っていなかったことから、破壊されたのは除外。
ということは白コロニーはlacZ遺伝子を持っていない。
つまりlacZ欠損株の大腸菌を用いて、lacZ遺伝子を含むプラスミドを形質転換に用いた。
これだとDNAがはいっていないコロニーは白くなり、入っているコロニーは青くなります。

でも白コロニーからプラスミドは取れたんですよね?
私の推理はちょっと間違ってるかも。
青コロニーと比べてサイズ的にどうでした?
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X‐galという酵素基質培地の酵素基質やlacZ遺伝子の働きが分かっている回答者がそう多くいるとは思えませんが。

(^^;

もう少し、遺伝子の働きと、コロニーの色からどういう酵素を持っていることが分かるかを説明した上で、なんで疑問なのかを質問し直してみてはいかがでしょうか?

参考URL:http://www.eikenkizai.co.jp/product/baichi/escol …

この回答への補足

まずlacZ遺伝子がBガラクトシダーゼを作る。
Bガラクトシダーゼはラクトースを分解しガラクトースとグルコースにする。
同様にBガラクトシダーゼはX‐galをガラクトースと青い色素に分解する。
目的DNA断片をプラスミドのlacZ遺伝子内のマルチクローニングサイトに挿入する。(これによってlacZ遺伝子は破壊される。=Bガラクトシダーゼを作れない)

よって青いコロニーを形成したものはlacZ遺伝子を破壊されなかった(挿入されなかった)
白コロニーのものはlacZ遺伝子を破壊された(挿入された)はずなのに白で挿入されてなかったり、青で挿入されたものがあった。

補足日時:2004/06/29 03:59
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プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
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Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

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QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
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 この中から、目的のDNAが入っているプラスミドが欲しいわけですが、コロニーの外見からは区別がつかないので、当てずっぽうに何個かのコロニーから大腸菌を増やして、プラスミドDNAを調べてみないといけません。
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Q大腸菌の形質転換とアンピシリン

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Aベストアンサー

プラスミドには目的遺伝子+抗生剤耐性遺伝子(この場合アンピシリン耐性遺伝子)があるはずです。

1.コロニーを採取するまではアンピシリンが必要なのはわかりますね。プラスミドを持っているE.coliだけが生えるようにしているのです。

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ご参考になりましたら幸いです。

QpUCベクターについて

製品のサイトを見てもよく分からなかったので詳しい方いましたら
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pUC系(pUC18)はlacプロモーターを有していますが、
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分かりません。

よろしくお願いします。
ちなみに青白判定は行いません。

Aベストアンサー

ANo.1の回答には一部間違いがありますので勝手に補足させてもらいます。
そもそも、pUCタイプベクターは青白選択を行うために開発されたベクターですので、まずはその原理を理解されるのがよろしいかと。

まず、pUCタイプベクターなど、α-complementationによる青白選択を行うためのベクターには、lacプロモーター(lacP)、lacオペレーター(lacO)、そしてlacZ遺伝子のα-flagment部分が乗っています。
http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0329

また、青白判定を行う際にホスト株から野生型lacZが発現しては困るので、このような目的に使うホスト株(DH5α、JM109など)は通常ラクトースオペロンを欠失させています。この遺伝子型は出典によって異なりますがおおよそΔ(lac-proAB)やΔ(lacZYA-argF)U169などと表現されます。
ただしこれだとlacZ Ω-flagmentが発現していないので、別途ゲノム上(DH5α)、またはF'因子上(JM109)にlacZ Ω-flagmentを恒常的に発現させるための配列を導入してあります(遺伝子型:lacZΔM15)。
さらに、JM109などは、未誘導時のベクター上lacプロモーターからの発現を強力に抑制するよう、F'因子上に恒常発現変異型lacIを配置してあります(lacIq)。

IPTGによる強制発現誘導は、ゲノム上由来、ベクター上由来を問わずlacIqという遺伝子型を持つ大腸菌で特に有効です。というかlacIqによるlacプロモーターの発現抑制を解除するために使用します。JM109などのlacIqを持つホスト株にpUC18を形質転換し、IPTGを含む培地中で培養すると、ベクター上のlacプロモーターからの発現が起こり、培地中にX-galが存在すれば青くなります。逆にlacIq遺伝子型を持たないDH5αでは、pUC18を形質転換しX-galのみを含む培地上に播種するだけでコロニーは青くなります。

以上を踏まえ、質問者さんに対する直接の回答としては
「lacO領域を持っているのでIPTGによって発現誘導はかかる。ただし、lacIq遺伝子型が無い場合はIPTG無しでもそれなりに発現する」
となります。

ANo.1の回答には一部間違いがありますので勝手に補足させてもらいます。
そもそも、pUCタイプベクターは青白選択を行うために開発されたベクターですので、まずはその原理を理解されるのがよろしいかと。

まず、pUCタイプベクターなど、α-complementationによる青白選択を行うためのベクターには、lacプロモーター(lacP)、lacオペレーター(lacO)、そしてlacZ遺伝子のα-flagment部分が乗っています。
http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0329

また、青白判定を行う際にホスト株から...続きを読む

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルム...続きを読む

QDNAの定量方法

質問させてください。
肝臓からDNAを抽出する実験を行い、
白い糸状のDNAを得たのですが、
そのDNAを定量するにはどうしたらよいのでしょうか?

いろいろなものを調べて、吸光度というのを利用するのかな?
と思ったのですが、その意味も分からないし、方法もよく理解できません。

どうか、教えていただけませんでしょうか?
よろしくお願いします!

Aベストアンサー

ゲノムDNAの定量の場合、ぱっと思い出せるのは、(1)分光光度計(吸光度を持つ共雑物がなければ定量性高)、(2)ゲル電気泳動(見たい分子量がゲノムDNAだと思いますのでアガロースがよいでしょう、定量性低)、(3)定量PCR法(リアルタイム-PCR)、(4)Invitrigen社のPicoGreenアッセイキット、(5)アジレントバイオアナラーザー2000といったところでしょうか。目的に応じて異なります。簡単で汎用性が高いのはダントツで分光光度計です。

Q遺伝子

形質転換効率ってどのように計算すればいいんですか?とても困っています・・・助けてください

Aベストアンサー

形質転換効率は、ベクター1 micro gあたりのコロニー数(colony forming unit, cfu)であらわします。
10 ngのプラスミドベクターを使って形質転換をして、1 mLの培地を加えて回復培養をし、そのうち10 microLをまいたら、250 コロニー生えたとしましょう。
まいた10 microLには10 ng x 10 microL/1000 microLで、0.1 ng 等量のプラスミドが含まれていることになります。
0.1 ngで250 コロニー生えたのですから、1 micro gに換算すると、250 cfu ÷0.1 ng = 250 cfu ÷( 0.1 x 10のマイナス3乗) micro g = 2.5 x 10の6乗cfu/ugとなります。これが形質転換効率を表します。
形質転換効率は、同じベクター、同じホストを使っても、ベクター量を少なくしたほうが高くなります。これは、ベクター量の増加と、形質転換数の増加が比例しないためです。

QアルカリSDS法におけるDNAとプラスミドの分離について

大学生になり、生物実験でアルカリSDSを行っている者です。
アルカリSDSによるゲノムDNAとプラスミドを分離する原理について色々な説明がありますが、よく分からないことがあります。solutionIIで菌体膜を壊し、プラスミドDNA及びゲノムDNAは一本鎖に解離します。そして、solutionIIIで中和することにより、比較的小さいプラスミドDNAは二本鎖に戻りますが、ゲノムDNAは1本鎖のままです。ある本では、この一本鎖DNAはタンパクとともに絡まって不溶性画分となって沈殿するのでプラスミドと分離できる、とありました。そしてボルテックスはsolutionIIを加えた以降は禁止で転倒混和ですが、これは激しいボルテックスによりゲノムDNAも粉々になって上清画分に出てきてしまうため、また、膜にゲノムDNAは結合していて膜とともに沈殿させることができるが、DNAが細かく切れると膜とともに沈殿させることができないため、という文もありました。疑問に思うことは以下の6つです。

(1)一本鎖になるとニックが入りやすくなるのに、プラスミドは二本鎖に戻し、ゲノムDNAを一本鎖のままにすることが、ボルテックスなどでゲノムDNAが細かくなるのを防ぎたいということと矛盾している気がします。細かくなると不都合になるのになぜわざわざ一本鎖にするのでしょうか?
(2)その後のエタ沈でDNAを沈殿させますが、一本鎖のほうが二本鎖より沈殿させやすいのしょうか?原理的にはDNAはエタノールに不溶性なため沈殿することを考えると、一本鎖でも二本鎖でも不溶性なことには違いがありませんよね?一本鎖の方がもつれて絡まりやすいから凝集するのでしょうか?
(3)ゲノムDNAは菌体の膜に結合していて一緒に沈殿しやすいというイメージがよく分からないのですが、膜に所々DNAが細胞骨格などとともに結合しているのでしょうか?何かのタンパクを介しているのでしょうか?
(4)solitionIでTris-HCl(pH.8.0)などの緩衝液を加え、菌体をボルテックスして懸濁する必要があるのは後のsolutionII以降の操作のためにどのような目的がありのでしょうか?EDTAでDNaseなどを不活性化するのは分かるのですが…。またグルコースも加えるのは何のためなのでしょう。Tris-HClで十分緩衝液になっている気がします。
(5)エタ沈の前に、フェノールクロロホルム抽出をはさむプロトコールがありました。フェノールクロロホルム抽出をはさまなくても、solutionIIのアルカリ性でタンパクは変性し、不溶性となるので、核酸と分離できるはずですが、はさむ方法もあるのは、よりタンパクを取り除くためでしょうか?
(6)こちらは、確認質問なのですが、エタ沈の目的は核酸の沈殿であって、タンパクとの分離はできませんよね?

ちまちまとすみませんが、どなたかよろしくお願いします。

大学生になり、生物実験でアルカリSDSを行っている者です。
アルカリSDSによるゲノムDNAとプラスミドを分離する原理について色々な説明がありますが、よく分からないことがあります。solutionIIで菌体膜を壊し、プラスミドDNA及びゲノムDNAは一本鎖に解離します。そして、solutionIIIで中和することにより、比較的小さいプラスミドDNAは二本鎖に戻りますが、ゲノムDNAは1本鎖のままです。ある本では、この一本鎖DNAはタンパクとともに絡まって不溶性画分となって沈殿するのでプラスミドと分離できる、...続きを読む

Aベストアンサー

(1) ゲノムDNAを一本鎖のままにしておくのが目的ではなく、プラスミドDNAだけを二本鎖に戻して可溶性画分へ移すのが目的です。
すでに質問者様がお調べの通り、比較的巨大な一本鎖DNAはアルカリ性(sol.2)から酸性(sol.3)に戻るときにタンパク質等と一緒に沈殿すると言われています。一方、プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます。もしゲノムDNAが断片化していると、このときにプラスミドDNAとともに可溶性画分として回収されてしまいますので(じゃまなので)、それを防ぐ為に穏やかな条件で回収しているのではないでしょうか。

(2)これはエタノール沈殿の条件では、一本鎖、二本鎖に違いはあまりないと思います。

(3)細胞質中で膜結合性タンパク質との巨大複合体として存在していると言われています。sol3の後の遠心で一緒に巻き込まれて沈殿する、というようなイメージではないでしょうか。

(4)EDTA等は、仰るようにDNAの安定化の為だと思います。
グルコースは浸透圧のコントロールとして、また後のエタノール沈殿のときにはDNAの共沈剤の効果があると言われています。浸透圧のコントロールとして塩を加えてもよいのですが、塩はDNAと不溶性複合体をつくりますので、最近のプロトコルはglucoseみたいですね(私が学生の頃はEDTA以外特になにも入っていませんでした)。後者はエタ沈の時にグリコーゲンを加える事があるのと一緒ではないでしょうか。

(5)仰るようにタンパク質を完全に除去する為です。目的によっては省略してもよいでしょう。また、フェノクロの後はフェノールを完全に除去するためにクロイソ処理が必須です。

(6)この場合のエタ沈はプラスミドDNAを単離することです。が、sol.3を回収すればタンパク質の分析も・・・できるかも。実際にQIAGENなどからは1本の培養系からDNA、RNA、タンパク質を同時に精製するkitがあります(ありました。今はちょっとわかりません)

(2)と(3)はゲノムDNAのtopologyの問題ですかね。
僕は専門ではありませんので、曖昧です。すみません。

(1) ゲノムDNAを一本鎖のままにしておくのが目的ではなく、プラスミドDNAだけを二本鎖に戻して可溶性画分へ移すのが目的です。
すでに質問者様がお調べの通り、比較的巨大な一本鎖DNAはアルカリ性(sol.2)から酸性(sol.3)に戻るときにタンパク質等と一緒に沈殿すると言われています。一方、プラスミドDNAや断片化した小さなDNAはリアニリングして可溶性画分に移ってしまいます。もしゲノムDNAが断片化していると、このときにプラスミドDNAとともに可溶性画分として回収されてしまいますので(じゃまなので)、そ...続きを読む

QDNAとゲノムDNAの違い

DNAとゲノムDNAの違いを教えてください。
遺伝子とDNAの違いはわかるのですが、上記の2つについてはわかりません。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

ゲノム
http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%B2%E3%83%8E%E3%83%A0

DNA
http://ja.wikipedia.org/wiki/DNA
DNAは化学的な物質名で人口に合成した化学物質でも、その化学的構造を持っていればDNAといいます。

ゲノムDNAの定義はよく分かりませんが、真核生物などはミトコンドリアなどにもDNAがあり、それと区別してゲノムDNAといえるかもしれません。また、ウイルスが感染しいて、染色体以外にDNAが存在する時、両者を区別するのにそういう表現ができると思います。


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