酵素によるでんぷんの分解について

実験１
１．０．２％可溶性でんぷん溶液を９ｍｌとり、３０度に温める
２．アミラーゼ１ｍｌ加えかくはんし、この時間をｔ＝０とする。
３．０．３ｍｌを(1)～(6)のルゴール液を入れた試験管に５分ごとに加えていく。
室内に放置し、吸光度を測定

実験２
実験１と同じで温度を４５度に

実験３
１．アミラーゼ１ｍｌを９０度で１０分間温める
２．でんぷん溶液を９ｍｌずついれ、かくはんする。この時間をｔ＝０に
３．０．３ｍｌを(1)～(3)のルゴール液の入った試験管に１０分ごとに加えていく。吸光度を測定

ヨードでんぷん反応の示す青紫色（６６０ｎｍにおける吸光度）を測定してその減少速度を酵素反応速度とする。


以上の実験なんですが、うちの班は上手く吸光度が下がりませんでした。（あがったりさがったり）
これは何が作用されたのでしょうか？
また、３０度だとアミラーゼが活発になる１歩手前、４５度だとちょっといきすぎ。
これはどっちの温度がベストになるのでしょうか？
４５度の方が失活される前でまだ生き残ってる確率が高いと考えたのですが。。。

ちょっと急ぎです・・・ご教授お願い致しますm(_ _)mm(_ _)m

No.1 ベストアンサー 回答者： noname#10563 回答日時： 2005/01/18 10:52

いくつか補足要求と情報

アミラーゼは一般にαとβがありますが今回の実験に
使用したのはα型ですかね？
どちらも45℃程度の温度では失活しません。
最適温度は60℃よりも高いです。
90℃まであげれば失活します。

うまくいかないのはあなたの班だけですか？
同じ酵素とでんぷんを使用した班でうまくいったところは
ありますか？

上がったり下がったりとのことですが，例えば１５分後
の吸光度が１０分後の吸光度よりも大きくなるといった
現象が出ているんでしょうか？
（であれば，酵素は関係なく単なるミスだと思いますが）

実験１，２ 両方うまくいかないのですか？

（1）から（6）って同じもの？

わかる範囲でもいいですから補足ください。

実際に見ていませんからどこまでフォローできるかは
わかりませんが・・・・

この回答への補足

ご回答ありがとうございます。

今回使用したのはαーアミラーゼです。
また、今回はかなり多くの班がきれいに成功はしていないようです。

（１）～（６）は全て同じモノです。
０分が（１）、５分が（２）・・・２５分が（６）としました。
だいたいは順々に下がっているのですが、２０分のところだけ、１５分よりも高くなってしまいました。

また見た目の色ですが、視覚ではほとんどわからないくらい同じ色でした。
ただ、アミラーゼを新しくしたあとに実験を行った班は見た目にも色にはっきりの違いが現れたようでした。

実験１の方が上手くいきませんでした。


考察に何をかいていいか迷っています。。。
ご回答、本当に感謝いたします。よろしくお願いします

補足日時：2005/01/18 20:29

No.3 回答者： kgu-2 回答日時： 2005/01/19 20:09

>室内に放置し、吸光度を測定

実験1のこの操作ですが、こんな雑なことは、教員が指示しないハズですが。テキストを確認して下さい。
>やはり体温に近い方
　反応液が徐々に冷えていくので、反応中は何度なのか不明なので、考察が困難です。このとおりでしたら、実験の内容があまりにもズサンです。
　研究室で、本気でやるなら、セルを持続的に暖めて、連続的な変化を見ます。

>実験結果は、45度は0分が吸光度0.455で0分～20分までは0.4以上の中で、徐々に下がりました。最終的には0.360でした。
30度は0分は吸光度0.430で5分から0.372とがくんと落ちてその後0.3あたりを徐々に下がっていきました。最終的には0.302でした。
　至適温度をご存知ですか。温度を体温より上げると、反応速度と酵素の熱変性の競争になります。45度くらいなら、30分程度は変性に耐えられるのが普通なのですが・・・。
　
　操作に誤りが無かったと仮定しての話ですが、酵素の濃度が低すぎた、という可能性はあります。これに、試験管が汚れていたり、傷ついていたりすると、このように結果になるかも。化合物の濃度が低い場合は、試験管への吸着は、常に頭の中に入れておかなければなりません。酵素液の容器が、プラスチックなら、なおさらです。
　あるいは、教員が酵素液を長期保存していて、イカレカケの酵素ということも。

　レポートは、可能性を羅列するしかないのでは。「考える」という目的には、適したデータかも。
　投稿の規約からすると、書き過ぎかもしれませんが、実験に興味をもつ、すなわち、何故を考える習慣をつけると、時間はかかりますが、楽しく実験できますので。

　試験管を洗わないで、中身を捨てて、水道水ですすいだ程度でも、ほとんどの実験には使えるのでは。
　それなのに、丁寧に洗うのは・・・、と考えて下さい。

この回答へのお礼

室内に放置というのは・・・
室温に戻すために放置する
とテキストにも書いてありました。

やっとレポート提出終わりました。
みなさんのおかげで、無事考察も考え書くことが出来ました、ありがとうございました。

＞試験管を洗わないで、中身を捨てて、水道水ですすいだ程度でも、ほとんどの実験には使えるのでは。
　それなのに、丁寧に洗うのは・・・、と考えて下さい。

これはやはり「正確な結果をだすため」としか考えが浮かびません・・・

お礼日時：2005/01/21 22:11

No.2 回答者： kgu-2 回答日時： 2005/01/19 13:53

>また見た目の色ですが、視覚ではほとんどわからないくらい同じ色でした

ご想像のように、アミラーゼが十分には作用していない、と判断しますが。少しは、活性が残っている、と推察されますが。
　普通は、反応の最後の時点では、無色になるような濃度のアミラーゼ溶液を用意します。

　この原因は、教員側と学生側の両方が推定されてます。
教員側の場合は、用意した試薬を間違えた、濃度を間違えた、ということはあります。
　よくあるのは、学生がメスピペットの先を手で触って、それで試薬を採ります。そうすると、その試薬に、手の汚れが移るわけです。汚れの中には、当然微生物もあるわけですから、微生物によって試薬が分解され、約役立たず、というのはよくある風景です。手で触らなくても、使用前のメスピペットを実験台の上に転がしておけば、同じ結果になりかねません。私の経験では、2週間は使える試薬を、3日くらいで駄目にしてくれます。
　あるいは、試験管を洗うのは、何故だかお分かりでしようか。汚れていると、では不十分です。そのような汚れた試験管でも、放射能を測定するのであれば、おそらく影響せず、十分利用できます。
　
>吸光度が下がりませんでした。（あがったりさがったり）
　級光度は、どの程度違っていましたか。0.100と0.010では、判断が異なります。学生は、0.010でも違っていたと書きますが、違っているうちには入りません。0.020以上なら違っている可能性が大きいのですが。実際の数値があると判断できます。

　研究ではなく、学生実習のレポートのようですから、これから先は、お考え下さい。
というのも、学生実習では、私は正しい結果を要求しません。このようなトラブルのときに、どのように推察して、対応するかが一番の目的だと考えています。それを考察に筋道立てて科学的に書けること、それが最も重要だと判断しています。

　実習自体は、1の場合、温度は37度で一定が常識です。私なら、室内放置なんぞの雑なことは教えません。酵素反応は、反応温度は重要だからです。
　このように、改良できる部分はまだまだあるので、「改良して、このようにする」と考察するのも、一つのレポートです。

この回答への補足

ご回答ありがとうございます

＞普通は、反応の最後の時点では、無色になるような濃度のアミラーゼ溶液を用意します

ということは濃度が低かったということでしょうか？
実験に使用したのはテキストによると、
(Ｂacillus subtilis由来アミラーゼ2μｇ/ｍｌ　ｐＨ7.0　50ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中)
でした。

＞学生がメスピペットの先を手で触って～

確かに手で触っていました。また実験台の上にもおいていました。
また、試験管を洗う理由については前回使った試薬や指紋などの汚れを取り除くといったことしか頭になかったです。。

＞吸光度の差
ちょうど0.02くらいの差でした。


実験前の講義の際に
42度を超えるとアミラーゼは作用しなくなる＝たんぱく質でできているため、42度で分解されてしまう。
と習ったのですが・・(もしかしたら私が勘違いをして解釈してる可能性もありますが)
実験の設問で
「30度と45度で15度あがるとアミラーゼ活性はどのように変化するのでしょうか？」という問題があります。

isisanさんのご回答によると、どちらも45度程度じゃ失活されないと教わりました。

実験結果は、45度は0分が吸光度0.455で0分～20分までは0.4以上の中で、徐々に下がりました。最終的には0.360でした。
30度は0分は吸光度0.430で5分から0.372とがくんと落ちてその後0.3あたりを徐々に下がっていきました。最終的には0.302でした。

傾き的には30度のほうが落ちているのですが、やはり体温に近い方が分解が適切に行われているということで良いのでしょうか？

補足日時：2005/01/19 14:07