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高速液体クロマトグラフ(HPLC)で内部標準法を採用したいと思っているのですが、
内部標準としては何が一般的なのでしょうか?
HPLCに詳しくないので、ご存じの方、是非、お願いいたします。

今後の一般的な知識としても欲しいのですが、現在、欲しいと思っているのは
 カラム:ODS系(ex.shim-pack CLC-ODS)
 移動相:MeOH/リン酸緩衝液系
で用いれるものです。

是非、よろしくお願いいたします。

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A 回答 (2件)

基本的なところはNO.1で答えられているとおりですが、ピークの理論段数やシンメトリー係数なども問題でしょうし、当然検出波長で吸収をもつ物質が前提となります。



参考までに、UV検出器で、質問されている条件において、測定波長が254nm付近と仮定すると、パラオキシ安息香酸エステルなど汎用されているようです。
パラオキシ安息香酸、同メチル、エチル、プロピル、ブチルなどは、ご質問の条件において、保持時間が遅くなっていきますので、わりと使いやすいと思います。
保持時間が近すぎる場合でも、移動相のpHを変えたり、メタノールをアセトニトリルにかえるだけでも、分離はかなり異なってきます。
内標準物質を設定する上では、予め移動相を決定しておくのではなく、内標候補のいくつかから、さらに移動相条件を変えていって分析条件全体を設定する方法が一般的だと思います。

経験則上、割と有効な方法を
 水/MeOH系では、有機溶媒の量を移動相の比率で10%増やすと、保持時間は約半分になります。アセトニトリル系だと約1/2~1/3になります。もちろん移動相のpHにも影響されますが、大体当てはまるので、内標を探すときの保持時間調整に使えます。

ぴったりした分析条件が見つかったときってうれしいもんですよ。
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基本的には、測定されるものと反応しないもの、ピークがかぶらずに検出器で検出されるものでしたら何でもいいと思います。

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QHPLCでの内部標準とは

HPLCでの分析初心者です。
サンプル抽出時に、内部標準を加えることによって何が変わるのですか?基礎的なことだと思うのですが、難しくてよくわかりません。すみませんが、わかりやすく教えてください。

Aベストアンサー

Text 形式しか使えないので、ちょっと書きにくいんですが、その点は堪忍してください。

まず Recovery Rate (回収率) から説明したほうが、わかりやすいと思うのでそちらから。また一般論にすると、却ってややこしくなるかもしれないので、具体的な数値を使います。ご自分で一般化してください。

Matrix: Plasma 1 mL を使う
Analyte: Ci mg/mL
I.S.: S mg を 1 mL の Matrix に加える。

ここで、検量線は、0 から始まり、数 Points の濃度にしますね。これを処理して、最終的に HPLC に Load するために調製した溶液 (processed sample) を 200 microL にするとします。

I.S. が、100% 回収できたとすれば、processed sample 中の絶対量は、S mg/ 200 microL = 5S mg/mL になりますね。このうち 20 microL を HPLC に Load するとすれば、I.S. は、0.5S mg 入ることになります。これに対応する Response (Ri) が、観察される筈です。

実際には、抽出過程でのばらつきがあるため、観察される Response は、Sample により R'i のようにばらつくはずです。この R'i / Ri を絶対回収率 (Absolute Recovery) と言います。

同じように、検量線の場合は、加えた Ci は既知ですから、同じように Absolute Recovery を求めることができます。

次に、各 Sample 内での、Analyte と I.S. の関係を考えます。Matrix 中には
 Analyte Ci
 I.S. S
入っていますね。この両者の、抽出などの過程で生じる Absolute Recovery が、一定値 (多少のばらつきはありです) a だったとすれば、processed sample 中には、
 Analyte aCi
 I.S. aS
となるので、量は変化しますが、Analyte / I.S. の比は、一定になります。そこで、上げられた例のように、aS に由来する Response のばらつきは a に依存するので、Response がばらばらになることはありえます。ここで、Analyte の Absolute Recovery が、常に I.S. のそれに等しいのであれば、Analyte の Response も aCi になるので、Analyte / I.S. は、もともとの Matrix 中の比と同じになるので、検量線が、きれいに引けることになります。

これがまさに内標準法を採用する一つの目的です。検量線は、添加した濃度 (Concentration added) に対し、HPLC で得られる Analyte と Internal Standard の比 (Ratio of onserved Value) を回帰して、求めます。

これとは別に、絶対検量線法というのもあって、これは Analyte の Response そのものを回帰します。挙げられた例をこの方法で回帰したときには、ろくな検量線にはなりえませんね。これは Sample ごとの、Absolute Recovery のばらつきが大きいのです。このようなときにも、同じような Recovery を示す I.S. を用いることで、補正しているのです。


さて、もうひとつの方というのは、ここまでの話でお分かりのように、Analyte / I.S. が一定である、ことをまず証明、
 具体的にはある狭い範囲での直線性を確認します。
した後、単独の試料に一定量の I.S. を加え、分析。Response の比から、濃度を出してしまうものです。これは、単なる溶液になっているなど、Matrix が単純な場合用いる方法です。予想値が高い場合は、希釈する程度の操作で済むときに使います。実際の使用例は、動物に薬物を投与するときの溶液 (正式な用語は、被験物質調製混合物) の濃度検定 (きちんとした濃度でなければ投与量が計算できませんから)、被験物質調製混合物中の被験物質の安定性 (調製した後一定条件下で保存している間に壊れないかどうか) を調べるときに用いています。No. 2 が言われているのは、これに相当します。

参考に挙げたのは、FDA の正式 Document で英語ですが、実際にどういう目的で用い、どういう処理をするか、判定基準も含めて、きちんと記載しています。可能であれば、一度読んでみてください。検量線の処理方法などは、世界的に authorize されているのはこの文書だけです。

参考URL:http://www.fda.gov/cder/guidance/4252fnl.htm

Text 形式しか使えないので、ちょっと書きにくいんですが、その点は堪忍してください。

まず Recovery Rate (回収率) から説明したほうが、わかりやすいと思うのでそちらから。また一般論にすると、却ってややこしくなるかもしれないので、具体的な数値を使います。ご自分で一般化してください。

Matrix: Plasma 1 mL を使う
Analyte: Ci mg/mL
I.S.: S mg を 1 mL の Matrix に加える。

ここで、検量線は、0 から始まり、数 Points の濃度にしますね。これを処理して、最終的に HPLC に Load するため...続きを読む

Q統計学でいうRSD%とは何ですか。

統計学でいうRSD%の平易な説明と計算方法を知りたいのですが。標準偏差はわかります。

Aベストアンサー

RSD%とは、相対標準偏差をパーセントで表示したものと思われます。

相対標準偏差(%)=(標準偏差/平均値)×100

次のページは、「相対標準偏差 RSD 平均値」で検索して出たものの一つです。
http://www.technosaurus.co.jp/product/mlh_faq_sd1.htm

参考URL:http://www.technosaurus.co.jp/product/mlh_faq_sd1.htm

Q検量線の計算方法について

こんにちは。
現在HPLCを扱っております。検量線を使っているのですが
計算方法がよく理解できておりません。
【化粧品100g中に有効成分Aは何g含まれているか】を求めるものです。
まず、
標準品 0g、0.1g、0.3g、0.5g を精密に量り、全て精製水で正確に
100mlとします。この各液から、さらに1mlを精密に量りとり、精製水を
加えて正確に100mlとします。

試料は 1mlを精密に量り、精製水を加えて正確に100mlとしました。

ピークのAREAですが【標準品】
0.1g→ 574221
0.3g→ 1671182
0.5g→ 2717212
【試料AREA】は1738876 です。
Excelで検量線の計算式を出したところ下記のような式になりました。
y=5E+06x + 46962  R2 =0.9998

この場合、100g中に何g含まれているかを求めるには
どうしたらいいのでしょうか?
私なりに計算して四捨五入で0.3gとなったのですが
あっているでしょうか?

長くなってしまいましたが、教えてください!

こんにちは。
現在HPLCを扱っております。検量線を使っているのですが
計算方法がよく理解できておりません。
【化粧品100g中に有効成分Aは何g含まれているか】を求めるものです。
まず、
標準品 0g、0.1g、0.3g、0.5g を精密に量り、全て精製水で正確に
100mlとします。この各液から、さらに1mlを精密に量りとり、精製水を
加えて正確に100mlとします。

試料は 1mlを精密に量り、精製水を加えて正確に100mlとしました。

ピークのAREAですが【標準品】
0.1g→ 574221
0.3g→ 1671182
0.5g→ 27...続きを読む

Aベストアンサー

ちょっと整理するために長くなりますが、順番に書きますね。

1.まず検量線に用いた標準溶液の濃度をきちんと計算しましょう。
○標品 0g、0.1g、0.3g、0.5g
 →mgに換算すると0mg, 100mg, 300mg 500mg
○全て精製水で正確に100mlとする
 →濃度は0mg/ml, 1mg/ml, 3mg/ml, 5mg/ml
○1mlを量りとり精製水を加え100mlとする(100倍希釈)
 →濃度は0mg/ml, 0.01mg/ml, 0.03mg/ml, 0.05mg/ml
 →μgに換算すると0μg/ml, 10μg/ml, 30μg/ml, 50μg/ml

2.計算した濃度(μg/ml)を横軸xに、HPLCで得られた面積の値を縦軸yにしてグラフを描きます(エクセルならば散布図ですね)。
この時、0μg/mlの試料を分析したときの値も使いましょう(ピークが出ないのならば、面積は0とする)。

3.近似式を追加して検量線の式を計算させると、
   y = 54291x + 19103  R2 = 0.9997
となります。

4.これで検量線ができたので、未知試料を分析したときのピーク面積1738876をyの部分に代入して計算します。

5.xの値として31.6769...(μg/ml)と出てきます。

6.この値はあくまでも"分析した試料"の濃度です。目的としている化粧品1mlを100mlに希釈したものがこの濃度であることから、化粧品中の濃度は100倍して約3158(μg/ml)となります。mgやgに換算しなおすと、それぞれ3.2mg/ml、0.0032g/mlとなります。

7.もし【化粧品"100ml"中に有効成分Aは何g含まれているか】ということならば、単純に濃度に100mlをかけて、0.32gとなります。
ここで注意が必要なのは、【化粧品"100g"中に有効成分Aは何g含まれているか】となっていることです。厳密には100mlと100gは同じ量を表していません。化粧品100mlの密度(g/ml)が分かればこの値を0.32にかければ【化粧品"100g"中に有効成分Aの量】が出せます。密度が不明なときは、例えば100mlを正確に量り取ってから、その質量を精密天秤で測ってください。質量÷体積で密度が計算できます。

ちょっと整理するために長くなりますが、順番に書きますね。

1.まず検量線に用いた標準溶液の濃度をきちんと計算しましょう。
○標品 0g、0.1g、0.3g、0.5g
 →mgに換算すると0mg, 100mg, 300mg 500mg
○全て精製水で正確に100mlとする
 →濃度は0mg/ml, 1mg/ml, 3mg/ml, 5mg/ml
○1mlを量りとり精製水を加え100mlとする(100倍希釈)
 →濃度は0mg/ml, 0.01mg/ml, 0.03mg/ml, 0.05mg/ml
 →μgに換算すると0μg/ml, 10μg/ml, 30μg/ml, 50μg/ml

2.計算した濃度(μg/ml)を横軸xに、HPLCで得られた面...続きを読む

QHPLCカラムの洗浄方法

逆相のカラムは使用後に必ず水で洗浄した上で、適当な水:溶媒系に置換するものだと思っていたのですが、今私が勤務しているところでは、誰も水で洗いません。ていうか、50%アセトニトリルを流すことを「洗浄」と称しています。実際、これでいいんですかね?

Aベストアンサー

#6です。お恥ずかしい限りです。
おっしゃる通り、「水:メタノール=9:1」の間違いです。別の分析条件でよく使っていたのでついつい・・・。

それから、#7さんの回答でもうひとつ思い出しました。どのようなバッファーだったかは忘れましたが、移動相をメンブランフィルターに通してからでないと使えないものがありました。

brassardさんの直面している条件で有効かどうかわかりませんが、予防の意味で一度試してみては?

既に同様の処置を済ませた上でのご質問でしたらご容赦下さい。

Qガスクロマトグラフィー 内部標準法

DHAを内部標準法で計ろうとし、内部標準物質にトリコサン酸(C:23)を用いたのですが、なぜかEPAのところにピークが出てきてしまいました。カラムはキャピラリーではなく従来のガラスカラムを用いています。

試料を直接メチルエステルにして行う方法で、今まではこれでまったく問題なく脂肪酸組成を計れているので分析法は問題ないと思います。

トリコサン酸メチルの市販品を直接ヘキサンに溶かして打ってもEPAのところにピークがでてきました。

どなたか、どなたか、わかるかた、宜しくお願いしますーー。

Aベストアンサー

No.1のご回答のように、トリコサン酸(メチル)とEPAの保持時間(RT)が同じであったということでしょう。そもそも、、ガラスカラムは、キャピラリーに比べて理論段数が低いので、完全に分離できない可能性が高くなります。

試料にEPAが含まれないのであれば、それで脂肪酸組成を計れば良いでしょうし、EPAが含まれるのであれば内部標準物質を変える必要があるということです。

また、可能であればキャピラリーカラムを使った方が良いように思います。

QまたまたHPLCで教えてくださいな!

えっと、HPLCのベースラインのことでお尋ねします。

ズバリ、ベースラインが安定しません。
午後中流していたのですが、ずーーーーーーっと下がって(という言い方でいいのかな?)いくのです。
蛇行したりするのではなく、とにかく下がり続けるのです。

移動相をメタノール・アセトニトリル・リン酸緩衝液のものから
メタノール・アセトニトリル・クエン酸緩衝液に変えたところでこの現象です。
セルに気泡が入ってるのかなー、とも思いますが昨日までちゃんとラインは安定していて、
カラムも変えてないし、一応脱気装置もついてるし・・・。

いったい何が原因なのでしょうか?
ちなみに測定物質は安息香酸です。

ちょっとでもヒントになることがあれば、ぜひぜひご教授ください。

Aベストアンサー

>>溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。
>えっ、そ、そうなんですね・・・。(^^;)
>すいません、知らないことだらけで・・・。

カラムや溶離液の種類によって差異はありますが、頻繁に溶離液や圧を変更するとカラムの寿命が短くなります。カラム内の溶離液を交換する際は流量(圧)を下げ、時間をかけて穏やかにやるのが基本です。

rei00さんもおっしゃるように水で充分に洗浄したほうがよいでしょう。いきなりメタノールを通すと無機塩が析出してしまう可能性も生じてきますから。水で洗浄後、水/メタノール混合溶液→メタノール→水/メタノール混合→水、最後に使用する緩衝液といった順番で流せばいいように思います。有機物が付着している可能性があるのならば、メタノール洗浄後にアセトニトリルや場合によっては2-プロパノールで洗浄するのもいいかもしれません。


rei00さん、こんにちは。
>>溶離液を流しっぱなしにしておくと自然に問題が解決
>>することもよくあります(答えになっていないけど)。
>これは溶離液を流しっぱなしにした事で,系内の溶離液交換が完了した結果だと思いますが。いかがでしょうか。

そうですね。私が体験したトラブルの原因は、ほぼ100 %これによるものと考えています。

>>溶離液を頻繁に変えての系内洗浄は必ずカラムを外した上で行ってください。
>えっ、そ、そうなんですね・・・。(^^;)
>すいません、知らないことだらけで・・・。

カラムや溶離液の種類によって差異はありますが、頻繁に溶離液や圧を変更するとカラムの寿命が短くなります。カラム内の溶離液を交換する際は流量(圧)を下げ、時間をかけて穏やかにやるのが基本です。

rei00さんもおっしゃるように水で充分に洗浄したほうがよいでしょう。いきなりメタノールを通すと無機塩が析出してしまう可能性も...続きを読む

Q緩衝液の濃度

緩衝液の濃度は何を基準に決まりますか?
20mMリン酸バッファーとか。
動物の臓器を使って実験しています。
タンパク質を扱うならこれくらい、とかありますか?
ウェスタンブロットなどよくやるんですけど、事あるごとにバッファーなのはなぜですか?
酸化を防ぐためかと思っていたのですが、生化学的に緩衝液を利用する意味なんかがあったら教えてください。

Aベストアンサー

>事あるごとにバッファーなのはなぜですか?
>酸化を防ぐためかと思っていたのですが、生化学的に緩衝液を利用する意味なんかがあったら教えてください。

緩衝液の主たる役割は溶液のpHを安定させることです.多少の酸やアルカリが入ってきてもpHが変動しにくくなっています.

生物由来のサンプル(DNA,RNA,タンパク)で実験を行う場合には,生体内に近いpH条件がなければ求める反応が起きてくれません.したがって生化学実験では緩衝液を頻繁に使用するわけです.ウエスタンブロッドも然り.

緩衝液の種類はいくつかありますが,どの範囲のpHでも緩衝できるわけではなく,それぞれ緩衝液固有の(緩衝能力に優れた)pHが存在します.
例えば,リン酸緩衝液は約pH6.7~7.7くらい,トリス塩酸緩衝液は約pH7.8~8.8くらいといったように.
pH=pKaの緩衝液は最も緩衝能力に優れます.

したがって緩衝液ならどれでも良いわけではなく,使用したいpH範囲の(実験の目的に合った)緩衝液を選択する必要があります.

特に生化学実験ではリン酸緩衝液,トリス塩酸緩衝液を使用する頻度がやたら多いですね.
生体のpHから考えて,やはりそうなるのでしょう.

>事あるごとにバッファーなのはなぜですか?
>酸化を防ぐためかと思っていたのですが、生化学的に緩衝液を利用する意味なんかがあったら教えてください。

緩衝液の主たる役割は溶液のpHを安定させることです.多少の酸やアルカリが入ってきてもpHが変動しにくくなっています.

生物由来のサンプル(DNA,RNA,タンパク)で実験を行う場合には,生体内に近いpH条件がなければ求める反応が起きてくれません.したがって生化学実験では緩衝液を頻繁に使用するわけです.ウエスタンブロッドも然り.

緩衝...続きを読む

Qエクセルで計算すると2.43E-19などと表示される。Eとは何ですか?

よろしくお願いします。
エクセルの回帰分析をすると有意水準で2.43E-19などと表示されますが
Eとは何でしょうか?

また、回帰分析の数字の意味が良く分からないのですが、
皆さんは独学されましたか?それとも講座などをうけたのでしょうか?

回帰分析でR2(決定係数)しかみていないのですが
どうすれば回帰分析が分かるようになるのでしょうか?
本を読んだのですがいまいち難しくて分かりません。
教えてください。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるための指数表記のことですよ。
・よって、『2.43E-19』とは?
 2.43×1/(10の19乗)で、
 2.43×1/10000000000000000000となり、
 2.43×0.0000000000000000001だから、
 0.000000000000000000243という数値を意味します。

補足:
・E+数値は 10、100、1000 という大きい数を表します。
・E-数値は 0.1、0.01、0.001 という小さい数を表します。
・数学では『2.43×10』の次に、小さい数字で上に『19』と表示します。→http://ja.wikipedia.org/wiki/%E6%8C%87%E6%95%B0%E8%A1%A8%E8%A8%98
・最後に『回帰分析』とは何?下の『参考URL』をどうぞ。→『数学』カテゴリで質問してみては?

参考URL:http://ja.wikipedia.org/wiki/%E5%9B%9E%E5%B8%B0%E5%88%86%E6%9E%90

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるた...続きを読む

QHPLCのピーク時間の誤差

同じ物質をHPLC分析した時、ピーク時間は0.1程度は誤差が出るものなのでしょうか。
例:物質Aを分析すると1回目は4.55に、別の時には4.65でピークが出てくる

Aベストアンサー

インジェクションマシンをご利用なら理由は不明に近いです。
手でインジェクションするなら、ばらつきます。

なお重大なのは保持時間自体ではなく保持時間の相対比です。
今は全てインテグレータが処理してくれるので、インテグレータの設定で揺らぎがキャンセルできるような現象は余り気にする必要はありません。
問題はその範囲におさまらない場合か、保持時間が一方方向に不可逆に移動する場合です。

>0.01分の誤差だったらおかしくない
全ては比率ですから、保持時間四分なら「気分が悪い」程度。
二十分なら無視です。

QHPLCの負のピーク

HPLC初心者です。
HPLC分析結果に、どの物質を分析しても必ず1分台に負のピークが出てしまうのですが、
これはなぜなのでしょうか。
また、負のピークは本来なら出てはいけないものなのですか?
わからないことばかりですみません。
どなたかお願い致します。

Aベストアンサー

私の経験から先に結論を言いますと、負のピークがでても測定に問題ありません。
  但し、インジェクション部、カラムの接続部等に問題がないことが前提です。
  もう一度各部を点検してください。


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