共焦点顕微鏡で植物組織(クロロフィル蛍光)
の観察をしています。
原理的には、切片が厚くても
任意の深度に焦点を合わせられる筈
だと思うのですが、
実際にやってみると、かなり薄い切片を
作らないと、きれいな画像が得られません。
これはどうしてなのでしょうか?

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A 回答 (4件)

補足です。


生試料で無ければならないのでしょうか?
固定処理をして、通常の脱水、キシレン、バルサム封入だけでも、透過性はかなり上がると思います。
クロロフィルの自家蛍光は残ると思いますよ。

一方、生でなければならない理由があるようでしたら、表面の情報のみを使うと割りきった方がいいかもしれません。厚切り切片であっても、落射型蛍光顕微鏡の特徴から、表面から数ミクロンまでであればきれいなデータは取れる可能性が高いと思います。どこまで行けるかは、Zセクショニングして検討してみてはどうでしょう。
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この回答へのお礼

補足回答ありがとうございました。
生でなくてはならない理由は、
(固定、脱水、封入したサンプルでも
 自家蛍光が残ることを知りませんでしたので)、
とにかくすぐにデータが欲しかったからです。。。
同時にTEM用のEPON包埋試料も作成して
おりますが、それでもクロロフィルの蛍光は
観察できるのでしょうか?

次回から、Zセクショニングで最表面のスキャンを
試みてみたいと思います。
ありがとうございました。

お礼日時:2005/04/24 10:29

#2です。

書き忘れたことがありました。
安息香酸ベンジルとベンジルアルコールを1:1の割合で混合したものは水と混ざりません。もしお使いになるのでしたら、バルサムなどで封入する時と同じ要領で、サンプルをエタノール脱水する必要があります。
また、脂溶性の高いものはこの溶液に溶け出してしまいます。もしかするとクロロフィルも溶け出してしまうかもしれません。
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この回答へのお礼

補足回答ありがとうございました。
参考にさせていただきます。

お礼日時:2005/04/24 10:22

厚手で透明ではないのサンプルの場合、レーザー光や励起されて生じた蛍光が乱反射で弱くなってしまうようです。

動物組織を免疫染色したものなどでは、安息香酸ベンジルとベンジルアルコールを1:1の割合で混合したものに浸けて透明度を上げてから観察していました。
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この回答へのお礼

とても参考になりました。
植物(針葉樹)の葉を輪切りにしたものを観察しているのですが、
透明ではないもので、かなり薄く切らないときれいな画像は得られません。
透過処理ができると良いのですが。

回答、ありがとうございました。

お礼日時:2005/04/21 22:30

共焦点でも厚手の試料場合、光の乱反射が原因になるかもしれません。

原理的には、データ採取は試料中を光が直進する場合を想定しています。しかしそうならない場合は、理論的によい像を得ることはできません。その場合は何らかの透過処理をする必要があると思います。

ただ、私自身、植物で厚手の生の資料を観察したことはありませんので、的はずれかもしれません。あしからず。。
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この回答へのお礼

光の乱反射が原因だったのですね。
生の植物のクロロフィル蛍光を観察しているので、透過処理はできないと思います。
やはり、きれいに薄切りにするしかないようですね。
回答、どうもありがとうございました。

お礼日時:2005/04/21 22:24

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 レンズの明るさ(正しくはそのレンズによって作られる像の明るさと
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AとDとは比例関係にあるので
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 焦点距離が大きくなると、No.2のお答えにあるように、像の明るさは
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Aベストアンサー

病気ではないと思います。
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Aベストアンサー

まあ、相手とする生物にもよりますが、ポイントは(1)微生物の密度を増やすこと(2)微生物の自由を奪うこと(3)視野をできるだけ広げること、でしょうか。
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焦点同士の距離と短径との比の値を第二離心率という。

第三離心率もあるらしいのですが、幾何学的にどういう意味があるのでしょうか。
数式でなく、言葉で表現したいです。

楕円の場合、
長径と短径との差と長径との比の値を第一扁平率という。
(楕円が円に球に比べてどれくらい扁平か(つぶれているか)を表す値で、円では値が 0 である。つぶれるに従って値は 1 に近づく。)
長径と短径との差と短径との比の値を第二扁平率という。

第三扁平率もあるらしいのですが、幾何学的にどういう意味があるのでしょうか。
数式でなく、言葉で表現したいです。

Aベストアンサー

 第三離心率だの第三扁平率なんて知りませんでした。
 第×扁平率はどれも長径と短径の長さの差、第×離心率はどれも焦点同士の距離を、楕円のサイズを表す適当な「基準の長さ」で規格化し(て、相似な楕円ならどれも同じ値になるようにし)たもので、ただしその「基準の長さ」が
 第一××率では長径の長さ。
 第二××率では短径の長さ。
ところが第三××率になると、
 第三扁平率では、楕円を囲む最小の長方形の周の長さの半分。
 第三離心率では、楕円を囲む最小の長方形の対角線の長さ。
と、基準が違っている。

 扁平率では: 第一の「基準の長さ」 + 第二の「基準の長さ」= 第三の「基準の長さ」
 離心率では: (第一の「基準の長さ」)^2 + (第二の「基準の長さ」)^2 = (第三の「基準の長さ」)^2
という関係を見ると、どうもここまでで話が完結してるっぽく、何か具体的な計算の便宜のために導入されたんだろうなと思われます。つまり、第n扁平率の逆数をフィボナッチ数列にしちゃえとか考えるのは、オイタが過ぎるということか。

Q蛍光顕微鏡について教えて下さい。

蛍光顕微鏡の原理は細胞などみたい試料を蛍光物着色液につけて、
見たいタンパク質に蛍光物質でマーカーした状態で蛍光顕微鏡で見るというものだと思うのですが、
・具体的にタンパク質に蛍光物質というのはどういう化学反応で結びつきあっているのでしょうか?

・後から蛍光物質を取り除くことは出来るのでしょうか?

・ありとあらゆるタンパク質に対応していないと思うのですが、やはり着色出来ない(見ることの出来ない)タンパク質も存在するのでしょうか?

Aベストアンサー

免疫染色
一次抗体、二次抗体
Alexaシリーズ

これらについて調べてみてください。

基本的なことが知識としてぬけていると思われるので、まずそこから勉強されることをお勧めします。

頑張ってください。

Q長焦点鏡筒と短焦点鏡筒の違い

よく望遠鏡のカタログを見ると、大口径の短焦点屈折式鏡筒(F値が小さいもの)は淡い星雲・星団を見るのに最適と書かれています。また低倍率広視野角で最適とも書かれています。大口径だと集光力が増して、淡い星雲・星団を見るのに最適なのは理解できるんですが、なぜ短焦点だと適するんですか?なんか長焦点の鏡筒でもそれなりに口径が大きければ、集光力は増して短焦点と同じくらいだと思えて仕方ないんです。

例えば、長焦点の鏡筒と短焦点の鏡筒と較べた場合、仮に同じ口径で、同じ焦点距離の接眼レンズを使用した場合、長焦点のが高倍率になる・・・これは計算上わかるんですが、接眼レンズを変えることにより、長焦点鏡筒と短焦点鏡筒を同じ倍率にした場合、高倍率ではどちらが適しているとか、低倍率ではどちらが適しているとかあるんですか?

(例)
長焦点鏡筒(口径100mm)・・・焦点距離900mm+接眼レンズ6mm使用
短焦点鏡筒(口径100mm)・・・焦点距離500mm+接眼レンズ3.5mm使用

例の様に接眼レンズを使用すると共に倍率は140倍~150倍となると思うんですが、この様に共に高倍率にした場合、鏡筒の焦点距離及びF値の違いによる見え方の特性の違いを教えて頂きたく思います。
また、対照的に接眼レンズの焦点距離を長くして、低倍率で見ようとした時に異なる接眼レンズの焦点距離を使用して同じ倍率にした場合の見え方の特性も教えて頂きたいです。

世の中には大口径(140mmや150mmの口径)の屈折式鏡筒が売られていますが、いずれも焦点距離は短く、F値は6以下です。この様な鏡筒は低倍率での星雲・星団に適しているとありますが、高倍率での惑星観察は不向きなのでしょうか?例えば、口径100mm程度でも長焦点の鏡筒の方が高倍率での月面,惑星観察は適しているのでしょうか?
そこの辺りがよくわかりません>-<

F値9,F値7.7,F値5とか、いろいろな値がありますが、高倍率での月面,惑星観察も低倍率での銀河系観察でも、OKなんていう、調子のいい鏡筒なんてないものなのでしょうか?

素人なもので、文面に意味不明、大きな勘違いがあったら申し訳ありません。
誰かご回答よろしくお願いします。

よく望遠鏡のカタログを見ると、大口径の短焦点屈折式鏡筒(F値が小さいもの)は淡い星雲・星団を見るのに最適と書かれています。また低倍率広視野角で最適とも書かれています。大口径だと集光力が増して、淡い星雲・星団を見るのに最適なのは理解できるんですが、なぜ短焦点だと適するんですか?なんか長焦点の鏡筒でもそれなりに口径が大きければ、集光力は増して短焦点と同じくらいだと思えて仕方ないんです。

例えば、長焦点の鏡筒と短焦点の鏡筒と較べた場合、仮に同じ口径で、同じ焦点距離の接眼レンズを...続きを読む

Aベストアンサー

>よく望遠鏡のカタログを見ると、大口径の短焦点屈折式鏡筒(F値が小さいもの)は淡い星雲・星団を見るのに最適と書かれています。また低倍率広視野角で最適とも書かれています。

 大口径の利点はおっしゃるとおりなのですが、
低倍率広視野が淡い星雲・星団を見るのに最適である理由をお話します。
 星雲・星団や惑星など倍率を上げると大きく見えるようになる天体の明るさは、対物レンズの口径だけでなく倍率も関係し、倍率を上げると暗くなります(恒星は倍率を上げても大きく見えてきません)。
 なぜなら、対物レンズで集めた限られた量の光を使うので、倍率を上げて像を大きくすると像の単位面積あたりの光量が減るので暗くなります。
 ですから星雲のような淡い天体を見るには低倍率のほうがよいのです。
 それと、低倍率ですと実視野も広くなるので、もともと見かけの大きさが大きい星雲星団向きなのです。
 その低倍率を得るには短焦点の対物レンズのほうが有利なのです。
 長焦点で低倍率を得るには接眼レンズも長焦点にすればいいのですが、長焦点の接眼レンズは作りにくく大きくて高価なものになりやすいのです。
 余談ですが、一般には高い倍率が出せる望遠鏡のほうが高性能だと思われがちですが実際には逆で、より低い倍率が出せるもののほうが高級品でしょう。
 もうすこし細かい話をしますと、天体望遠鏡や双眼鏡で最も明るく見たければ、その望遠鏡の射出瞳の直径が7ミリになるような倍率にします(7ミリというのは暗闇で人の瞳が最も開いたときの大きさで、そのときの倍率がその望遠鏡の最低倍率です)。
 一方、望遠鏡の倍率は対物レンズの口径を射出瞳の直径で割っても求められます。
 質問者さんが例に挙げている口径100ミリですと、最も明るく見るための倍率は100/7で約14倍です。
 この倍率を出すには、短焦点の500ミリですと約36ミリ、長焦点の900ミリですと約64ミリの接眼レンズが必要になります。 
 36ミリでもかなりの長焦点接眼レンズですが、64ミリともなると作られているかどうかわからないくらいの長さです。
 
 なお、月や惑星のような明るい天体の場合は、倍率を上げても暗くなって見にくいということはほとんど無いので、細部観察のための高倍率を得やすい長焦点の対物レンズのほうが有利でしょう。

 射出瞳についての説明はサイトの検索で調べてみてください。
 望遠鏡を明るいほうへ向け、接眼レンズからずっと目を離してレンズの真ん中を見たときに見える丸く光ったものが射出瞳です。


 
  
  
 
 
 
 
 

>よく望遠鏡のカタログを見ると、大口径の短焦点屈折式鏡筒(F値が小さいもの)は淡い星雲・星団を見るのに最適と書かれています。また低倍率広視野角で最適とも書かれています。

 大口径の利点はおっしゃるとおりなのですが、
低倍率広視野が淡い星雲・星団を見るのに最適である理由をお話します。
 星雲・星団や惑星など倍率を上げると大きく見えるようになる天体の明るさは、対物レンズの口径だけでなく倍率も関係し、倍率を上げると暗くなります(恒星は倍率を上げても大きく見えてきません)。
 な...続きを読む

Q蛍光顕微鏡について

癌細胞を大学院の研究でしている者です。蛍光顕微鏡を使って細胞を観察したと論文を読んでいると頻繁に出てきますが、蛍光顕微鏡を利用する利点、欠点はどんなことでしょうか?
また現在は蛍光顕微鏡を利用してはいないのですが将来的に利用するとしたら蛍光試薬以外に必要な物がありますでしょうか?
大学院生ですが分子生物学の経験が浅いのでぜひご意見お願いします。

Aベストアンサー

経験が浅いのでしたら、
ここで書けるだけの情報で蛍光顕微鏡について理解するのは困難だと思います。
日本語でかかれた本もたくさんありますので、
そちらを見た方が参考になると思います。


蛍光ということはタンパク質か何かの局在を見ているのだと思いますが、
利点、欠点の比較対照は発色でしょうか。

利点
発色と比べて、シャープな像が得られる
生きている細胞を染色することも出来る場合がある
多重染色をしてもフィルターを使うことでそれぞれの局在を見やすい(発色でも二重染色は出来ますが、それぞれの色のみの写真は取れないと思います)

欠点
蛍光顕微鏡などで励起光を当てないと蛍光が出ない
フィルターが高い
励起光用のランプも高い
室温で不安定な場合がある(酵素での発色よりも安定な場合もありますが)
励起光が当たることにより褪色する(わざと褪色させるフォトブリーチというのもありますが)

>利用するとしたら
サンプルを用意する
必要ならば洗浄、固定やPermeabilizationをするための試薬がいります。
スライドガラス、カバーガラス、封入剤などもいります。
これらの操作を行うための器具も要ります。

蛍光色素自体が標的と結合することが出来ないのならば,抗体などと結合する必要があります。
必要な励起光をだせる蛍光顕微鏡やフローサイトメーターなどが要ります。

経験が浅いのでしたら、
ここで書けるだけの情報で蛍光顕微鏡について理解するのは困難だと思います。
日本語でかかれた本もたくさんありますので、
そちらを見た方が参考になると思います。


蛍光ということはタンパク質か何かの局在を見ているのだと思いますが、
利点、欠点の比較対照は発色でしょうか。

利点
発色と比べて、シャープな像が得られる
生きている細胞を染色することも出来る場合がある
多重染色をしてもフィルターを使うことでそれぞれの局在を見やすい(発色でも二重染色は出来ます...続きを読む


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