アルカリ抽出がうまくできません

アルカリ法でプラスミドを抽出しましたが、何回やっても目的のDNA断片と他にそれより大きいバンドが出ます。今ある大小混ざったプラスミドの懸濁液から目的のプラスミドのみにする方法や、プラスミド抽出できれいに抽出するこつがありましたら教えてください。

No.2 ベストアンサー 回答者： geneticist12 回答日時： 2005/06/20 17:58

抽出したプラスミドは、一般的に次の３つのフォームをとります。

１．CCC (Covalently Closed Circular) または、Super coil：intact（無傷）のプラスミドで、２重らせんがきつく巻いて、プラスミド自体がコンパクトによじれている状態。
2. OC (Open Circular)：プラスミド分子内で少なくとも一箇所、二重鎖の一方に切れ目（nick)が生じたため、cccの状態を保てなくなって、開いた輪っかになった状態。
3. Linear : プラスミド分子内で、同じカ所で二重鎖の両方に切れ目が入って、線状になった状態。

一般的な電気泳動の条件では、CCCが格段に早く移動し、Linear（もちろん分子量マーカーと比較するとプラスミドの塩基数に一致します）、OCはほぼ同じくらいの移動度です（泳動条件によって前後します）。

大小さまざまなプラスミドというのが、これら３態のことなら、たいていの目的にはそのまま使えますので、あまり気にしなくてもいいです。

ただし、無傷のCCCではなくてはまずい実験もあります（in vitro translationなど）。厳密な実験には、塩化セシウム密度こう配超遠心でCCCを単離したりします。そうまでしないにしても、なるべくCCCの状態で精製するのにこしたことはありません。
そのために、注意すべき点は、
1. アルカリ処理の時間を過剰にしない。手早くかつ優しくまぜて、すぐ氷のうえに。
2. フェノール処理で激しく、長時間振らない。ボルテックスならごく短時間で。できれば手でinverting して混ぜた方がよいと思います。また、フェノールが古くて酸化変性していると、nickが入りやすいという話も聞きます。


別の可能性として、大腸菌のゲノムDNAがコンタミしているのかもしれません。これだと、ウェルに非常に近いところにバンドが見え、スメアーになります。これを防ぐには、アルカリ処理、塩析のときに激しく振らないこと。ゲノムDNAが断片化して沈殿として取り除きにくくなります。また塩析後、上澄みをとるときに沈殿を吸わないこと。塩を加えると同時に、クロロフォルムを一滴たらしておくと、遠心後、沈殿が底の方にパックされるので操作が楽です。

No.1 回答者： alice_with_tak 回答日時： 2005/06/20 16:16

さまざまなバンドが出てくるとのことですが、それはすべて同じものです。

プラスミドDNAはさまざまな構造をとるため、制限酵素処理をしないで電気泳動すると2～3個のバンドがどうしても出現します。