酵素活性について

HEK293に強制発現させた酵素タンパク質が酵素活性を持っていません。RT-RCRやウエスタンブロットにて遺伝子的にもタンパク質的にも発現しているのはまちがいないのですが....なにを変更していいのかが全くわかりません。もし以前同じような体験をされた方、どんな些細なことでもいいので、助けてください。参考になる文献もご存知でしたら教えてください

No.1 回答者： bzxjpjp 回答日時： 2006/06/28 16:23

発現タンパク質の精製段階で、失活している可能性が考えられるので、

精製方法やその時に用いるバッファーを再検討してみてはいかがでしょうか。

あと、得られた酵素タンパク質の濃度が低すぎるということはないですか？

この回答への補足

ありがとうございます。精製はしていなく、まだCrudeの系にて条件を検討しています。細胞を1％triton X似て融解後、トリスbufferに基質を加えて活性を（HPLCにて）測定しています。発現の段階でうまいことフォールディングされていないのならば、もう一度遺伝子の導入からですか？それとも、べつの方法等ありますか？

補足日時：2006/06/28 21:17

No.2 回答者： gori8063 回答日時： 2006/06/28 19:26

＃１さんを受けての意見ですが、Crudeの系でも酵素活性はみられませんか？

Crudeで活性がないようであれば、発現の段階でうまいことフォールディングされていないとも思えますけれど。

この回答への補足

ありがとうございます。精製はしていなく、まだCrudeの系にて条件を検討しています。細胞を1％triton X似て融解後、トリスbufferに基質を加えて活性を（HPLCにて）測定しています。発現の段階でうまいことフォールディングされていないのならば、もう一度遺伝子の導入からですか？それとも、べつの方法等ありますか？

補足日時：2006/06/28 21:10