コロニーが現れない

形質転換って失敗することあるんですか？

プレートの作り方がまずかったのでしょうか。

コンピテントセルを扱うときにコンタミは
そこまで致命的なものなのですか？
クリーンベンチでやった方がいいのでしょうか？

抗生物質の耐性を獲得して大腸菌が生えてくるはずなぜか生えてきません。

形質転換はclonaseという酵素を使って遺伝子を組み替えてから行っています。

No.4 ベストアンサー 回答者： Chicago243 回答日時： 2006/07/20 08:07

ストラテジーはま、方法みたいなもんです。

制限酵素認識部位を見逃してないかとか、ちょっとした見落として理論的には不可能なことをしていないかということです。

コンタミはさほど気にしなくていいです。クリーンベンチを使うほど厳密な無菌操作をやっているラボは少ないのではないかと思います。回りの人でファージを使っている人がいれば、ファージのコンタミを防ぐ注意が必要と思います。
バクテリアノコンタミは抗生物質で選択する限りほとんど気にすることはないと思いますし、イーストやカビは増える早さが遅いので、バクテリアのコロニーを拾うころにはまだコロニーは形成していません。

No.5 回答者： popporu 回答日時： 2006/07/20 19:03

この状況ではコンタミしておかしなものが生えてくることはあっても、

コンタミしたから生えてこないってことは普通に考えると無いです。

今までと同じやり方でやった場合に、
・抗生物質無しの培地ではコロニーが出来るのか？
・自分で作ったものではなく、すでに先輩とかがやって上手くいっているプラスミドを入れたときは、抗生物質あり培地でコロニーが出来るのか？
をとりあえずやってみることでしょう。
すでにやっているのでしたらすみませんが。

普通の大きさ(7、8kbくらい？)のプラスミドではそんなにトランスフェクションしないこと無いですけどね。
ヒートショック忘れても結構大丈夫だったし。
どっちかって言うとプラスミドを作るところで失敗することが多いように思うのですが。

この回答への補足

酵素の失活が問題でした。
形質転換が失敗してコロニーが出なかったわけではなかったようです。
コロニーが出ないことってたぶんあまりないんでしょうね。

補足日時：2006/07/22 13:21

No.3 回答者： Chicago243 回答日時： 2006/07/19 05:16

ストラテジーンス

はストラテジーの間違えです。訂正します。

この回答への補足

ストラテジーって何ですか？

補足日時：2006/07/19 20:13

No.2 回答者： Chicago243 回答日時： 2006/07/19 04:38

形質転換って失敗することあるんですか？

意外とうまく行かないという話が多いです。操作自体はそんなに難しくないのですが、何が重要なのかとか把握してないと、全然目的のコロニーができなくて、分子生物なんていやだなんてねをあげてしまう人もいます。
コロニーが生えない時は、トランスフォーメーションの効率が悪いということがいえると思います。なぜ悪くなったかですね。コンピテントセルがよくないかもしれません。プラスミドの量や質は大丈夫でしょうか?コンストラクトトラのストラテジーンスは大丈夫でしょうか?あとプレートは適切な抗生物質を適切な量使っているでしょうか。
トランスフォーメーションの方法自体はそんなに難しくないので問題はあまりないと思います。

各ステップについて何か適当なポジコンはないかとか、考えながらやってみてはどうでしょうか

この回答への補足

コンピの効率が大きく関係するようですね。プラスミドの大きさなども関係するようです。
これに関しては市販の高効率のDH5αを使っているので問題ないと思います。

それより聞きたいのが、プラスミド溶液を入れる時などにコンピの蓋を開けると思いますが、
クリーンベンチでやるもんなんですか？
コンタミで失敗することあるんですか？

補足日時：2006/07/19 20:11

No.1 回答者： nayu-nayu 回答日時： 2006/07/18 22:09

コンピテントセルは自分で作りましたか？

セルの出来にも影響されますので必ずしも上手くいくとは限りません。
そのため、形質転換効率が良いと言われている市販のコンピテントセルだってあります。


http://www.amazon.co.jp/gp/product/4879621498/

この回答への補足

DH5αという高い効率を持つものです。
コンタミで失敗することってあるんですか？
クリーンベンチでやっていなくても
失敗しないと先輩はいっていましたが。

補足日時：2006/07/19 20:09