No.5
- 回答日時:
培養物を処理した後にカラムにロードしますが、
その時に所定量の3倍くらいをロードしましょう。
単純にロードの操作を3回するだけです。
つまりカラムに対してかなりオーバーロードになっているはずです。
後の操作は同じにすれば、キットに期待できるくらいの濃い液が
とれているはずです。
それでも薄ければ、途中の操作が悪いのでしょう。
一度先輩に横についてもらって実験を指導してもらってはいかがでしょうか。
No.4
- 回答日時:
やはり濃度を上げるには、培養の段階から検討した方がいいと思います。
Hispeedは使ったことがありませんが、始めに3ml程度の培地で6,7時間培養し、その後100mlの培地にその培養液100μlを入れて、そこから14時間程度培養します。この過程がまず収量をあげる大事なステップです。
次に大切なのは遠心後の菌のペレットの懸濁です。自分は10mlピペットで懸濁した後、だめ押しで1mlのマイクロピペッターでさらにピペッティングします。目視では分からない菌の塊が先の細いチップにより完全に懸濁されるわけです。
最後にイソプロ沈殿のあとの70%エタノールでの洗いをしっかりやることです。これをおろそかにするとDNAの溶解度が極めて低下して、結局は収量の低下を招きます。
以上3点を守ることで、自分の場合はlow copyのプラスミドでも随分収量が上がりました。
No.3
- 回答日時:
>トラブルシューテイングなどを読みましたがよくわかりません。
ということは、量が思ったより取れていないということでしょうか。
kitは簡単で便利ですが、原理を熟知してないと、思わぬところで苦労することがあります。
培養液量を増やす、最後の溶出液で溶出を繰り返すなどの手もあるかと思いますが(Hispeed plasmid midi kitは使ったことが無いのでわかりませんが)、シリンジを押す力などちょっとしたコツがあると思います。何回も使用経験のある方(あるいはキアゲンのテクニカルサポート)にお聞きになるのがよいと思います。
単に濃度を上げたいならエタ沈ですが、このkitは最後にエタ沈(イソプロですが)しますね。イソプロ入れた後、遠心してみては?
DNAの沈殿がでるはずです。
注)Hispeed plasmid midi kitは使ったことが無いのでご参考まで
この回答へのお礼
お礼日時:2006/12/15 15:57
確かに少し最初の頃は押しすぎたりしていたこともあり、なかなかうまく行かないことが多々ありました。そのため、もう一度しっかり説明書を読んで確認し一定の圧力でシリンジを押すように心がけています。ここで質問したかったのは、濃度を上げることだったのでebikichiさんのおっしゃるようにイソプロを入れた後に遠心してみることにします。ありがとうございました。
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