液体培地で培養すると大腸菌が生えてこないんです。

当方、実験初心者です。初歩的な質問になりますが、よろしくお願いします。

目的遺伝子をインビトロジェンのTOPOベクターに組み込み、自作のコンピテントセル（XL10)にトランスフォームし、アンピシリン(Amp）入り寒天培地にまきました。
そこで生えたコロニーをピックアップしてLB+Ampに植菌しましたが、全く増えてきません。液体培地をTBに変更してみましたが、効果はありませんでした。
Amp濃度は１００μg／mlです。
この問題を解決する方法がございましたら、お教えください。
よろしくお願いします。

No.1 ベストアンサー 回答者： lamb1204 回答日時： 2006/12/08 02:50

初心者、を前提に回答させていただきます。

まずは以下の点を、再確認してみてください。
１）プレートを作製するときに、培地が熱いうちにAmpを入れませんでしたか？またはプレートが古すぎはしませんか？
→Ampは結構不安定なので、AmpRで選抜するならCb(50ug/ml)を使ったほうがいいかもしれません。またTOPOならKmRもあったとおもうので、Cb, Km両方入れてはいかがでしょう？プレートに入れたAmpが死んでいて、プラスミドを持たないのに生えてきたコロニーを拾ったのかもしれません。

２）液体培養する前にプレートのコロニーに対しダイレクトPCRなどをして、目的配列・プラスミドの導入を確認しましたか？
→目的配列が入っているようなら１）の心配もたぶんないと思います。

３）プレートでの培養、あるいはその後の保存は適切でしたか？
→死滅期近くになるほどに培養するとプラスミドをリリ－スしてしまったりします。

この回答へのお礼

回答、ありがとうございます。

1)確かに、プレートを作製するときに熱いうちにAmpを入れてしまいました。途中で固まるのをおそれるあまりに早めに入れてしまいました。Cbとは何でしょうか？（使ったことがありません。）とりあえず、Kmプレートで試してみようと思います。
2)ダイレクトPCRは行っていません。コロニーがすごく小さいこともあり、ミニプレップをしようと思ったためです。しかし、やってみようかと思います。
3)培養や保存条件は適切だと思います。

ご丁寧にありがとうございました。

お礼日時：2006/12/08 21:17

No.3 回答者： lamb1204 回答日時： 2006/12/08 23:09

1です。

補足します。

１）について
Cbはカルベニシリンの略のつもりで書きました。Ampより安定で、AmpRにより選抜できます。

２）について
滅菌した白チップ（P10,P2用）または爪楊枝でコロニーを拾ったら、まず、新しいプレートにクローン番号が分かるように整然と植菌しマスタープレートを作製しましょう。ダイレクトＰＣＲはマスタープレートをつついた後にわずかにチップに残った菌で充分です。マスタープレートを培養している間に、ダイレクトＰＣＲによるチェックを終わらせ、夜にダイレクトＰＣＲであたりだったクローンをマスタープレートからMinipre用の培地へ植えれば、リズム良く回りますよ。

この回答へのお礼

ありがとうございました！
カルベニシリンは、研究室にあるか確認してみます。
ダイレクトPCRは、そんなにちょっとの菌で大丈夫なのですね。
早速明日からやってみます！！
本当にありがとうございました。

お礼日時：2006/12/09 02:16

No.2 回答者： MIYD 回答日時： 2006/12/08 05:47

とりあえず一度、

コロニーを拾ってプレートに撒いてみてはいかがでしょうか。
それで増えない場合は、疑陽性かもしれません。

それでちゃんと増えるのであれば、
液体培地では増えない菌やプラスミドの条件なのかもしれません。

その場合は、プレート上で増やして、
それをSolIなどで洗って大腸菌を回収して、
それからプラスミドを回収できるかを試してみてはいかがでしょうか

この回答へのお礼

回答、ありがとうございます。
確かに、疑陽性の可能性もありそうですね。確認してみます。
また、その他の方法も試してみようかと思います。
ご丁寧にありがとうございました。

お礼日時：2006/12/08 21:20