DNAシーケンス

解決済

質問者：memememema
質問日時：2007/06/13 13:26
回答数：4件

DNAシーケンスがうまくいきません。
800bpのPCR産物をTベクターに組み込んでおり、M13ForwardとM13Reverseのプライマーを使用し、両方向からシーケンスしています。
M13Reverse側からはうまくシーケンスできるのですが、M13Forward側からはうまく読めません。
同じプライマーを使って、ほかのプラスミドをシーケンスするとうまくいくのですが、このサンプルはForward側から読めません。

使用しているシーケンサーはABI3730　キットはBig Dye V3.1です。
サンプル量、プライマー量はキットで推奨されている量を使用しており、Big Dyeは1／4希釈です。
何度シーケンスしても読めないのですが原因は何が考えられるでしょうか。また、、何か解決策はあるでしょうか。

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回答 (4件)

No.1

回答者： miya_0726
回答日時：2007/06/13 13:45

お使いのTベクターのプライミングサイトに、お使いのM13forwardプライマーが貼りつくか確認されましたか？

http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ …

このようにM13forwardだけでも4種類あって、ベクターによっては使えないものがあったはずです。

もし同じベクターを用いた別のサンプルで同じM13forwardプライマーで読めているのであれば、欠失が起こっていたりするのかもしれません。何度やっても読めないのであれば、私ならM13reverseで解読できたインサート内でプライマーを設計し、読み進めてしまいますが・・・。そうすればM13forwardプライミングサイトで何が起こっているか知ることもできますし。

いかがでしょうか？

この回答への補足

早速のご回答ありがとうございます。
M13プライマーについては確認済みです。
インサートの配列がわからなかったので、ベクターのプライマーを用いてシーケンスを行っていたのですが、Reverse側から読み進めていくのも一つの手ですね。
しかし、今後、同じベクター、同じプライマーを用いて、読めたり読めなかったりとなるのは・・・・。
一度ベクター側までシーケンスして、M13Forwardプライミングサイトを
確かめてみようと思います。
ありがとうございました。

補足日時：2007/06/13 13:55

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No.2ベストアンサー

回答者： fauna
回答日時：2007/06/13 14:20

M13ForwardプライマーがPCR産物内部の特定の配列とinteractしている可能性がありますね。

・Tベクターのforward側の別のプライマーを試してみる
・No.1さんがお答えのようにreverse側から読み進める
・PCR産物が逆向きに挿入されたクローンを鋳型にしてM13reverseで読む

以上のような対策をご検討してみてはいかがですか。

この回答への補足

早速のご回答ありがとうございました。
PCR産物内部にinteractしている可能性は今まで考えたことがありませんでした。
TベクターのForward側のプライマーはほかにも手持ちでありますので
それで読んでみるのが取り急ぎできる手段だと思いますので、
やってみようと思います。
ありがとうございました。

補足日時：2007/06/13 14:50

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No.3

回答者： tomoyaok
回答日時：2007/06/14 09:11

＃２に加えて、

インサートのＦ側が
・ＧＣ含量が多い
・ステムループのような構造的な問題
があることによって

反応が阻害されているかもしれません。

この回答への補足

ご回答ありがとうございました。
ご指摘のように、F側にシーケンスで読みにくい配列があるのかもしれません。
内部の配列がまだ未決定なので、R側から読み進めていきたいと思います。
しかし、もしそのような読みにくい状況ならば、Reverse側から読んでも反応が阻害されてしまう可能性もありますよね。
その場合は、どのように対応していけばよいのでしょうか。
よろしくお願いします。

補足日時：2007/06/14 09:12

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