PCRのノンスペバンドの正体・・・？

現在PCRでリコンビナントWT酵素のプラスミドを鋳型にして変異体の作製をしています。

新しくプライマーを合成し、まずはPCRプログラムやらプライマー濃度の検討のため、確認のPCRを行いました。すると、template+AS primer (S primerが入っていない)で、目的の位置より少し下にノンスペバンドが濃くみえました。
template+S+AS (本命？の系)でもバンドがうっすら確認でき、切り出しでの混入を避けたかったので、ASの濃度を半分に薄めて同じプログラムでもう一度PCRを行いました。

するとそのやや小さいノンスペバンドは消えたのですが、新たに目的位置よりかなり大きい位置と、下に二つバンドが出現しました。これはtemplate+S+ASでも見えました。

実際の切り出し位置には全く影響はないのですが、最初の濃度で見えなかったノンスペバンドが、濃度を半分にたら最初より濃く見えてくるっていうことがあるんでしょうか？？一部操作を自分以外の人間がやっているので、調製間違いが絶対ありえない！と強く主張はできないのですが。。。。
もし調製ミスではないとしたら、どういうことが考えられるのでしょう？？あまり経験がないのでこれといった原因が思いつかず困っています。教えてください。

No.1 ベストアンサー 回答者： blackdragon 回答日時： 2005/11/14 10:41

＞最初の濃度で見えなかったノンスペバンドが、濃度を半分にたら最初より濃く見えてくるっていうことがあるんでしょうか？？

あり得ます。
短い非特異の産物にカバーされていた、長い非特異の産物が増えるようになるということは、十分にあり得ることです。

ちなみに、アニーリング温度の検討は十分に行なっていますか？
非特異増幅が見られる場合、アニーリング温度を上げると消えることが多いですが、逆に、アニーリング温度を下げたほうがいい場合もありますから、２℃おき位で幅広く振ってみるといい条件がみつかることが多いですよ。

この回答へのお礼

ありがとうございました。なるほど。。。。検討してみます！

お礼日時：2005/11/16 09:58