現在、Western blottingをやっています。
目的のタンパクと陽性コントロールとしてβ-actinを反応させています。
目的タンパクもβ-actinもしっかりバンドが出るのですが、どちらとも2本線で出てくるのです。別のタンパクでやっても同様の結果でした。
原因として、
(1)1年以上前に購入した市販のゲルを使っているから
(2)泳動時の電流/電圧が高すぎて分離しきれていないから
(3)目的以外のタンパクも反応しているから
などと考えましたが実際どうなのでしょうか。教えてください。
No.1ベストアンサー
- 回答日時:
普通に考えると、反応はちゃんとしているので、ゲルが均一でない、それも厚さの中で(表面と裏側とで)ムラがあることが考えられます。
表面と裏側で伝導率が違うということ。
あとは、コームのサンプルチャージ部分が平らでなく勾配ができているか(でも、この場合は二重線というよりブロードになることの方が多いと思いますが)でしょうか。
No.2
- 回答日時:
>(1)1年以上前に購入した市販のゲルを使っているから
3つの中ではこれがいちばん怪しいですね。そんなにもつものではないです。
さらに疑わしいのはサンプルバッファーのなかの還元剤が劣化していて、タンパク質が還元不足になっていること。作り置きしているものなら新たに作り直し。2-ME、DTTストック溶液が古いようなら、新しく買う、作り直す。
http://www.bio-rad.co.jp/B2B/BioRad/jsp/default. …
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