PCRの失敗について

PCR後電気泳動したんですが、
バンドが出てきません。
PCRって失敗することあるんですか？

単にプライマーとテンプレートを入れ間違えたんでしょうか？

テンプレートの前後にPCRによりタグ（Hisタグ、制限酵素サイト、転写促進配列など）を付けているのですが。

もし仮にテンプレートとプライマーが合っていない場合、テンプレートだけのバンドは出てきそうですが。
そうでもないんでしょうか？

No.6 ベストアンサー 回答者： Chicago243 回答日時： 2006/09/03 12:33

>PCRってちゃんと溶液を混ぜてもできないことあるん

>ですか。
もう決まった条件があるのならまずうまく行かないことはありません。ですから試薬やサンプルに問題がある可能性が大です。
ただし、ちがうPCRマシーンをつかうと条件が変わってくる可能性があるので出ない場合は再検討してみることも考えたほうがいいことがあります。同じメーカで同じモデルでも機械が違うと違うとおっしゃる方もいます。
あとうまくいった時に使用したのと同じ種類のポリメラーゼを使ってますよね。それも確認した方がいいかもしれません。逆手にとって、手元に違う種類の酵素があれば使ってみるのも手かもしれません。たまにメーカーが間違ったプライマーを送って来ることがあるという話も聞いたことがあります。本当かどうかよく分かりませんが、メーカーの人に確認してもらうというのも必要なのかもしれません。

この回答へのお礼

間違ったのを送ってきたのかもしれませんね。
問い合わせてみます。

結構長いプライマーなのでうまくアニーリングできていないかもしれないですね。
酵素はKODでうまくいっているので問題ないと思います。やっぱりプライマーが問題そうですね。
アニーリング部分が一塩基でも違うとアニールしませんよね？
注文したプライマーがきちんとできていないと
クレームをつけないといけないですが。
メーカーはちゃんと配列を確認してから送ってくるのでしょうか？

お礼日時：2006/09/03 17:24

No.5 回答者： Chicago243 回答日時： 2006/09/01 08:30

なんとなくわかってきました。

プライマーは使用経験があり、PCRがかかるハズのものなのにうまく行かないということですね。試薬、サンプル、条件のどれかがおかしいわけです。プラスミド(テンプレート)の量は1-10ngなら選択として悪くはなと思います。で、テンプレートはこのレベルではほとんど検出できないと思います。エチブロでDNAの検出感度は10ng弱です。PCRのエラーを防ぐためにサイクル数を減らすという目的で、もっとたくさんのテンプレートを使う人もいますが、今回は前の方がやった条件を再優先するのがいいかと思います。
まず簡単にできること。水を変えてください、新しくmiliQから取った水あるいはそれをオートクレーブかけたもの。もし同じ試薬でほかの人とかが使ってワークしているものがあれば分けてもらいましょう。あるいは新しいものをつかう(古いものも同時にやってOKであったら古い方から使っていけばいいわけです)。テンプレートはプラスミドのようですがほかに違うクローンから取った同じプラスミドはないですか?同時に何種類か使ってみましょう。
KODということですが、もしかしてバッファーは2種類なかったでしたっけ(なかったかもしれないです)?MgCl2フリーのバッファーだとMgCl2を添加しないといけませんよ。前のうまく行った方法でなにかほかに加えていませんでしたか?ベタインとかDMSOとか。まとにかくプロトコールの再点検ですね。
あとプライマーの濃度とか気にしているようですね。260nmの吸収で確認できますよ?詳しくは試薬屋さんのとかたろぐのAPENDEXとかをみれはどれくらいの吸収が得られるかとか書いてますので確認して見れはどうでしょうか。あとうまく行った時のデーターなどノートを取っていれば見せてもらうのもいいかもしれません。ホットスタートをするかしないかだけでも全く違ったりすることがあります。

この回答へのお礼

回答ありがとうございます。
これまでPCRをやってバンドがでなかったことはないんですが、今回は何回やっても出ません。
とりあえず、アニーリング温度を下げてみましたが、
駄目でした。
100ngのものも流しているのでバンドは確認できました。以前、うまくいったもので試してみようと思います。
KODはMgSO4、10Xbuffer、dNTP、プライマー2種類、酵素、DWを加えます。
ちゃんと確認してやったんですが。

プライマーがたくさんあったので希釈を間違えたのかもしれません。乾燥状態で来たプライマーなので
TEで溶かさないといけないのです。

PCRってちゃんと溶液を混ぜてもできないことあるんですか。そういう場合はアニーリング温度を変える、下げるのがよいみたいですが。

お礼日時：2006/09/01 22:09

No.4 回答者： gori8063 回答日時： 2006/08/29 16:43

現在の状況がよくわからないんですよ。

・新規の研究で新たに設計したプライマーなのか
・先輩などが確立していた実験系＋プライマーなのか

前者ならプライマーの再設計でやってみる
後者なら実験器具から試薬まで、一からやりなおし＋先輩の操作確認作業つき

でなんとかなるのでは？
新規の系なら悩んで時間浪費するよりプライマー設計しなおすのが一番早いです。プライマー安くなりましたから。

この回答へのお礼

プライマーは先輩が設計して注文したので問題ないはずです。少々長いですが。
実験系も同じものを何回も行いました。
新規ではないです。
操作確認作業付きは無理だと思います。
先輩も忙しいですから。プライマーの希釈を
間違えた可能性も否定できないですが。
また、注文すると高いです。
プライマー安くなりましたが、1塩基65円ですよね？

お礼日時：2006/08/29 23:20

No.3 回答者： annet 回答日時： 2006/08/29 11:15

設計ミス、実験操作ミスなどがなければ、以下のようなことが考えられると思います。

テンプレートの濃度が高すぎる。

プライマー間の配列がGCrich で伸びにくい。

アニーリング温度が最適な温度ではない。

これらの可能性を考えてテンプレートの濃度をふったり、伸長しやすい酵素を使ったり、温度検討をしたりしてみてください。
どうしての点が問題になるのか原理的な点に着目して考えてみると良いですよ。

この回答への補足

テンプレートのバンドが出てこないのが
おかしいです。テンプレートの調整ももう一度やるのがいいと思います。
GCrichであります。
酵素はKODを使っています。
アニーリング温度もどうしてもできないなら
変えたいと思います。アニーリング温度もプログラムで求めたのですが。

補足日時：2006/08/29 23:20

No.2 回答者： Chicago243 回答日時： 2006/08/29 03:01

>テンプレートだけのバンドは出てきそうですが。

PCRのテンプレートはたいてい電気泳動で見えるほど必要としません(検出方法やPCRにもよりますが)。入れたテンプレートと検出感度を確認してみてはどうですか?あとそのPCRはかかることが分かっているものですか?もし、新たにプライマーを作ってPCRをやっているような場合は条件を振って最適な条件を見つけてください。あたNo1の方の指摘のように試薬がへたっている可能せいもありますのでポジコンを用意するのも手だと思います。

この回答への補足

ポリメラーゼが死んでいるかもしれないですね。
PCRにはどれくらいあればいいんですか？
1,10ngでやっていますが。

＞入れたテンプレートと検出感度を確認してみてはどうですか?あとそのPCRはかかることが分かっているものですか?
検出感度とは何ですか？
また、プライマーはテンプレートに結合（アニーリング）するように設計しました。
少々複雑ですが。

補足日時：2006/08/29 23:22

No.1 回答者： jetplane 回答日時： 2006/08/28 22:46

　様々な要因で失敗することがあります。

　プライマーを入れたつもりでも忘れていた。たとえば、３’側しか入れていなかった。

　温度設定、繰り返し回数などのプログラムミス

　プライマーの設計が悪い

　ＤＮＡポリメラーゼがへたっている

　機械自体が壊れている

　電気泳動の際、ゲルの濃度が薄く泳動時間が長すぎて全部流れてしまった

　などなどあります。試薬などを一度新しくしてそれでもダメな場合はサーマルサイクラーが壊れていることがあります。

この回答へのお礼

溶液の混合ができていないのかもしれませんね。
複数サンプルを同時に行ったので間違えたかもしれません。
電気泳動の時、流し過ぎということはないです。
プライマーの残骸であろうバンドは確認できましたから。

プライマーの希釈が間違えたのかもしれません。
乾燥状態で送られてきたものもあったので
溶けていないのかもしれないです。
しつこくボルテックスはしたんですが。

お礼日時：2006/08/29 23:28