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酵素(セリンプロテアーゼ)阻害剤のKi値の求め方を教えてください。酵素量・反応時間を一定にして低分子阻害剤の濃度をふってIC50値は求めたのですが、このほかにどんな実験を行ってどのような計算からKi値を求めればよいのでしょうか?できれば解説しているサイトも教えてください。よろしくお願いします。

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A 回答 (2件)

 生化学の教科書は御覧になっているとの事ですので,基礎的な事は省略いたします。



 Ki 値(阻害定数)を求めるには,2通りの方法があります。

【Lineweaver-Burk プロット】
 阻害剤が存在しない状態で,基質濃度を変えて反応速度を測定し,反応速度の逆数を基質濃度の逆数に対してプロットします(Lineweaver-Burk プロット)。

 同様に阻害剤が存在する状態(複数の阻害剤濃度を使用するのがベター)で Lineweaver-Burk プロットを書きます。

 上記のプロットを同じ紙に書いた場合の直線の交わり方から,阻害様式が求まります。

 Lineweaver-Burk プロットの傾きを求め,阻害剤濃度に対してプロットすると直線になります。直線のx切片(x軸との交点)が -Ki になります。

【Dixon プロット】
 反応速度の逆数を阻害剤濃度に対してプロットします(Dixon プロット)。直線になるはずです。

 基質濃度を変えて測定を行ない,各データを同時にプロットすると1点で交わります。この点のx座標が -Ki 値です。


 いかがですか。解り難いかと思いますので,参考 URL のページ(酵素反応速度論)の図なども御覧下さい。より詳しくは,酵素に関する実験書の類を御覧になる事です。

参考URL:http://biomol.gifu-u.ac.jp/~molbiochem1/practicu …
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 図書館で、大学レベルの生化学の教科書を読まれると、競争阻害(私は、拮抗阻害と教わった)など、阻害の形式について書いてあります。



 それをお読みになれば、あとは数学の問題です。私の大学の生化学の時間に、Ki値をもとめるライン-ユーバーバーグのプロットを講義を聞きました。IC50を求めることができる設備がおありなら、授業も受けておられるのではと想うのですが。式を書いても、お役には立たないと想います。
 企業の方なら、周囲には訊ねにくいかもしれません。そのときは、再度ご質問を。

この回答への補足

早速の回答ありがとうございます。実はその・・・企業に勤める者でして・・・まさに周囲は知っているものと思っているのです。生化学の教科書(みたいなもの)も斜め読みしたことはあるのですが、どうも机上の空論みたいなところがありまして、実際の実験結果からどのように導き出すかを知りたかったのです。また、そのためにどのような実験を組むべきかも。もう一度教科書を読んでみます。

補足日時:2002/08/08 05:52
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QIC50(50%阻害濃度)の単位について

論文を読んでいて、IC50というものを初めて知ったのですが、
少しわからないことがあるので、質問させていただきます。

IC50の単位として、ng/mlやnMといった単位が使われますが、
これの意味がわかりません。

参考にした文献には、対象となる酵素の量や濃度が書かれておらず、
どのくらいの量の酵素に阻害剤を加え、
50%阻害時のIC50を求めたのかがわからないのです。

ただ、私の考え方が根本から間違っており(たぶん間違ってますが)、
IC50とは、50%阻害時に加えた酵素阻害剤の量/酵素の量なのかなと思うのですが、どうなのでしょう?

つまり、1×1×1cmのセルに酵素を入れ、
そこに阻害剤を加え、50%阻害時の量を分子にして、IC50を求めるのでしょうか?

また、まったく別のことなんですが、
文献中に「chitotriomycin」という言葉がでてくるのですが、
これはキトトリオマイシンと読めばよいのでしょうか?

簡単なことなのかもしれませんが、
上記2点についてよろしくお願いします。

Aベストアンサー

タイトルにも書かれているようにIC50は50%阻害濃度(50% inhibitory concentration)と訳され,概念上はあくまでも「濃度」です。従って単位としてはng/mlやnMのような濃度を表わすものが使用されるのは自然だと思いますがいかがでしょう。
 「50%阻害時に加えた酵素阻害剤の量/酵素の量」だと少なくとも単位上は無名数の値になるのがわかると思います。

 IC50という場合の濃度は系に加えられた阻害剤のバルクの濃度を通常指します。従って酵素や受容体に結合してしまった分を差し引いた真の濃度は通常わかりません。それで酵素の濃度や量を書かないとおかしいのでは,と考えておられるのでしょうか。それであれば確かにそうでして酵素濃度の記載が見られる報告も多くあります。本格的に行なう場合は酵素濃度を振ってそれぞれの条件でIC50を求め,酵素濃度ゼロの時のIC50値を外挿して求めるのがスジかもしれません。
 しかし普通はそこまでしてIC50を求めることはないと思います。というのはIC50は多くの場合理論的には固有値とならない場合がほとんどだからです。例えば阻害剤が拮抗的阻害剤などの場合,測定上必ず基質を加えなければなりません。ところが拮抗的阻害剤は基質を競合的に追い出しますが,見方を逆にすると拮抗的阻害剤は基質により競合的に活性中心から追い出されます(これはレセプターに関した実験でも同様です)。つまり基質の濃度が高ければIC50は高くなり(阻害効果は弱めに出る),低ければ小さい値をとります。採用する基質の濃度が10倍違えれば,IC50も約10倍違ってきます。ということで酵素に結合した量を無視したとしても,IC50は条件に依存した非固有地であることがわかると思います。
 ではちゃんとした値はなにかというと,これは基質ゼロの時に求められるIC50値(50%結合濃度に相当)であり,熱力学的には解離定数となります。解離定数は等温等圧では条件によらない固有値となります。ただ基質濃度ゼロの時にはそもそも酵素反応などはかれませんから,実際にはIC50から特別な式を用いて逆算することになります。
 このように求めたKi値でも酵素に結合した阻害剤の量による誤差は出てきます。したがってきちんとKiを求める場合には先ほど述べたような酵素濃度を振るような方法が行なわれますが,ここまで徹底的に行なうのは稀だと思います。
 ご質問にピンポイントに答えてはいないかもしれませんが,IC50をめぐる背景はご理解いただけたでしょうか?

 chitotriomycinについてはすみませんがよくわかりません。

タイトルにも書かれているようにIC50は50%阻害濃度(50% inhibitory concentration)と訳され,概念上はあくまでも「濃度」です。従って単位としてはng/mlやnMのような濃度を表わすものが使用されるのは自然だと思いますがいかがでしょう。
 「50%阻害時に加えた酵素阻害剤の量/酵素の量」だと少なくとも単位上は無名数の値になるのがわかると思います。

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Q酵素 分子活性Kcatの算出方法

酵素学を初めてやろうとするものです。
何とかVmaxとKmは計算しましたが、kcatをどう算出すれば良いかがよく分りません。教科書で見たkcatの定義は(=Vmax/[E])と書かれており、ある単位時間に対して、タンパク質一分子当りどの程度の基質を生成物に変えられるかであることは分ってますが、Vmaxにはタンパク質の質量項があり、これを単純にタンパク質の分子量で割れば良いのかがよく判りません。ちなみに、Vmax = 60 umol/min/mg, Km = 5 mM, 分子量は15000 Da, 1 mL の中に 0.5 ugのタンパク質を用いています。
酵素学を専攻としてる方は教えて下さい。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

私がよく使っている方法です。
まずVmaxの単位をmol/minとなるようにしましょう。反応系に混ぜた酵素量は分かっていると思うので簡単だと思います。
次にEです。Eは全酵素量なので単位はmolです。分子量、酵素量は記入されされているのですぐに計算できますよね。
あとは計算すれば単位が/minとなってKcatがでてきます。

Vmaxに関しては参考書によって単位がまちまちですが私はよくM/secとして算出しています。このほうが後々の計算が楽になります。

参考 ヴォート 基礎生化学

QKcat/Km Kcatについて

Kcat/Km と  Kcatの意味をおしえてください。

よろしくおねがいします

Aベストアンサー

ごく簡単に言うと、他の過去問、↓の様な感じです。
http://detail.chiebukuro.yahoo.co.jp/qa/question_detail/q115032236
より厳密には、↓の(e)反応特異性のあたりを見て下さい。
http://square.umin.ac.jp/aoki530t/prorogu_daigaku/cyoubunshi3.htm

QIC50(50%阻害濃度)の出し方についてご教示ください。

IC50(50%阻害濃度)の出し方についてご教示ください。

とある物質の酵素阻害活性を測定しているのですが、
IC50値の出し方がいまいちわかりません。

現在の実験方法はサンプル毎の阻害率を以下のように求めています。
1.酵素、基質、阻害物質を加え反応させて吸光度を測定
 (反応生成物を比色法で測定しています)
2.得られた吸光度から、ブランクを差し引いて阻害率を求める式にあてはめて
 阻害率(%)を出す
 ((対照-サンプル)/対照)×100

という風に行っていました。
なので、阻害物質の濃度をふって(10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01ug/mL)
それぞれの阻害率を求めて、エクセルで検量線を作って
その式に当てはめて50%の値を求めたらよいのかな、と思ったのですが…
普通に散布図にしたら変な形のグラフになってしまいました。
いろいろ調べた結果、IC50を求めるときはx軸が対数のグラフを作るのでしょうか?
そのとき、阻害物質(x軸)の濃度の振り方も異なってくるのでしょうか?
(たとえば10, 5, 2.5, 1.25, 0.625…のほうが良いとか)

正直、数学が苦手でして対数にする意味などはさっぱりです…
どなたか、ご回答よろしくお願いいたします。

IC50(50%阻害濃度)の出し方についてご教示ください。

とある物質の酵素阻害活性を測定しているのですが、
IC50値の出し方がいまいちわかりません。

現在の実験方法はサンプル毎の阻害率を以下のように求めています。
1.酵素、基質、阻害物質を加え反応させて吸光度を測定
 (反応生成物を比色法で測定しています)
2.得られた吸光度から、ブランクを差し引いて阻害率を求める式にあてはめて
 阻害率(%)を出す
 ((対照-サンプル)/対照)×100

という風に行っていました。
なので、阻...続きを読む

Aベストアンサー

どんなグラフなのかわからないのであれですが

とりあえず、貴方の実験も対数でされているので問題無いです(0.01, 0.1, 1, 10, 0.05, 0.5, 5で実験しているので)
今回の実験をリニア(普通の)軸で取ると、一番右端が10になり左端が0.01≒0になります
真ん中が5、左から1/10が1になるので、右半分は殆どデータがなく左側にばかりデータ点が並ぶことになります
しかも、0.01と0.05, 0.1当たりの違いはグラフで書いて理解するのは困難だと思います
ですので、対数軸を使います
対数軸ですと、0.01と0.1が一目盛、0.1と1が一目盛となるのでデータ点が均一に並びます
あとは、10倍では飛びすぎているので、間の点として5を選んだということで、それぞれの間に5x10^nのデータが並びます

データ点はある程度規則的に並んでいた方が良いですが、厳密に取る必要はないです
(リニア軸でいうと1, 1.6, 2, 2.6, 3, 3.6などでも良い)
ですので今回の濃度のままで問題ないと思います

Qミカエリス・メンテン式でKmとVmaxは出せる?

次の表のデータから、酵素反応のミカエリス定数Kmと反応最大速度Vmaxを求めなさい。

基質濃度S(mM)⇒反応速度V(μM/min)
1⇒2.5
2⇒4.0

また、反応に酵素阻害剤(I)が存在したとき、次のデータが得られた。
この阻害剤の阻害様式を答えなさい。

基質濃度S(mM)⇒反応速度V(μM/min)
1⇒2.0
4⇒5.0


とありました。
ミカエリス・メンテン式を用いて
V=Vmax・S/Km+Sとすると、KmとVmaxは同時に出せない気がするのですが・・・
どうやって出すのか、わかる方、よろしくお願いします!!!

Aベストアンサー

いくつかやりかたがありますが、ちゃんと覚えておかなければなりません。

例えば、
横軸にS-1 を、縦軸にV-1 をとってプロットすれば直線になる(ラインウィーバー・バーク プロット)事を利用して求めることが出来ます。

くわしくは、あなたが持っている教科書を読みなおしましょう。

Wikipediaの“ミカエリス・メンテン式”を見るだけでも、だいたい分かると思います。
阻害様式についても解説があります。

Q吸光度の単位

吸光度の単位は何でしょうか!?
一般的には単位はつけていないように思われるのですが。。
宜しくお願いします。

Aベストアンサー

物理的には、No.1さんも書かれているように吸光度も透過度も基本的に同じ単位系の物理量どうしの「比」なので「無単位」です。しかし、無名数では他の物理量、特に透過度と区別が付かないので、透過度は"透過率"として「%」を付けて表し、"吸光度"は「Abs(アブス)」を付けて呼ぶのが業界(分析機器工業会?)のならわしです。

QKm値について

Km値について

Km値は基質に対する酵素の親和性だと習いました。
Km値が大きくなるほど、親和性が上がるということでしょうか。
ミカエリスメンテンのグラフからはKm値が小さくなるほうが、親和性が上がる気がするのですが。

わかる方、回答よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

>>Km値が大きくなるほど、親和性が上がるということでしょうか。

逆です。
ミカエリス定数はV=(Vmax・C)/(Km + C)で表されます。(Vは反応速度、Vmaxは最大反応速度、Cは基質濃度)

ミカエリス定数Kmが大きいと、分母が大きくなり、反応速度Vは小さくなります。

反応速度が小さいと言うことは、基質との親和性が小さいということを意味します。

Q酵素の活性について

前期に大学で酵素の活性について学びました。酵素の活性を示す式として、ミカエリス・メンテンの速度式があると学びました。この式における、VMaxおよび、Kmはどのような意味を持つのか教えて下さい。

できたら、なぜそう考えられるのかという理由も一緒にお願いします。

Aベストアンサー

Vmaxは最大速度

http://ja.wikipedia.org/wiki/%E9%85%B5%E7%B4%A0
>Km と表記され「ミカエリス・メンテン定数」と呼ばれる。ミカエリス・メンテン定数とは、酵素と基質の親和性を表すパラメータであり、実測値としては酵素の最大速度の2分の1の反応速度 (Vmax/2) を有する基質濃度となる。Km 値と基質親和性の関係は以下の通りである。

Km値が低いと酵素と基質の親和性は高い(酵素と基質は相性が良い)
Km値が高いと酵素と基質の親和性は低い(酵素と基質は相性が悪い)
-------------
基質親和性が高ければ、基質濃度が低くても、Vmax/2を達成しやすくなるから。

Q競合阻害と非競合阻害

なぜ、競合阻害では最大速度は不変で、非競合阻害ではKmが不変になるのですか?競合阻害剤は酵素の基質との結合を妨害するが、触媒作用を妨害しないからで、非競合阻害剤は酵素と基質との親和性を変えないからと言われてもよくわかりませんでした。どうかよろしくお願いします。

Aベストアンサー

まず、最大速度は、基質濃度が無限大のときの反応速度です。つまり、そこにある酵素がすべてESになった時の反応速度です。ですから、基質と活性部位を競合する阻害剤が有限濃度なら、無限に濃い基質とは競合できません。したがって、競合阻害剤では、最大速度は変わらないのです。
つぎに、非競合阻害剤は結合しても、基質と酵素の結合には影響しません。だからEI複合体にさらにSが結合して、ESIができます。つまり、酵素の基質に対する結合しやすさ、言い換えれば親和性は、阻害剤の影響を受けないのです。しかしESIからは反応生成物ができませんから、反応最大速度、つまりそこにある酵素が最大限作用して実現できる反応速度は、全部がESにはなれず、一部はESIとなって反応から外れていますから、阻害剤がないときよりも小さくなります。
なおEI,ESIがともにできるが、つまり非競合阻害剤と同じように作用するが、EとESとではIの結合に対する親和性が違う場合は、混合型の阻害になります。

Qエクセルで計算すると2.43E-19などと表示される。Eとは何ですか?

よろしくお願いします。
エクセルの回帰分析をすると有意水準で2.43E-19などと表示されますが
Eとは何でしょうか?

また、回帰分析の数字の意味が良く分からないのですが、
皆さんは独学されましたか?それとも講座などをうけたのでしょうか?

回帰分析でR2(決定係数)しかみていないのですが
どうすれば回帰分析が分かるようになるのでしょうか?
本を読んだのですがいまいち難しくて分かりません。
教えてください。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるための指数表記のことですよ。
・よって、『2.43E-19』とは?
 2.43×1/(10の19乗)で、
 2.43×1/10000000000000000000となり、
 2.43×0.0000000000000000001だから、
 0.000000000000000000243という数値を意味します。

補足:
・E+数値は 10、100、1000 という大きい数を表します。
・E-数値は 0.1、0.01、0.001 という小さい数を表します。
・数学では『2.43×10』の次に、小さい数字で上に『19』と表示します。→http://ja.wikipedia.org/wiki/%E6%8C%87%E6%95%B0%E8%A1%A8%E8%A8%98
・最後に『回帰分析』とは何?下の『参考URL』をどうぞ。→『数学』カテゴリで質問してみては?

参考URL:http://ja.wikipedia.org/wiki/%E5%9B%9E%E5%B8%B0%E5%88%86%E6%9E%90

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるた...続きを読む


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