固定した組織のウエスタンブロット

動物に起炎物質を投与してそこで発現する蛋白の免疫染色を行っています。しかし凍結切片を作製して染色してもうまく染めることができません。起炎物質の失活か、投与ミスか、あるいは抗体が古いためにラベルが外れたのか、発色工程に問題があるのか原因が不明です。
そこで、固定ずみの凍結切片（４％PFA、OCTで包埋済み)をブロックから切り出してウエスタンで目的のものを確認できないかと考えていますが、一度固定した組織片をミクロトームで薄切し、その薄切片をSDS/DTT存在下でsonicationあるいはboilなどで可溶化し、目的蛋白の発現を確認することは可能でしょうか？固定しているので、もはや可溶化することはできないでしょうか？
Vehicle投与群と起炎物質投与群の間で差があれば、再度免疫染色を再検討しようと思うのですが。ご経験のある方のご意見がいただければ幸いです。

No.1 ベストアンサー 回答者： otx 回答日時： 2008/06/18 09:41

おそらく組織も全く違うと思いますし、私の場合はTCA固定したものですが試みたことがあります。

やるだけ無駄でした。

sonicationではなくホモジナイズでしたが、黙視できるほど可溶化してませんでした。また、ウエスタンの結果のわけわかりませんでした。

＞起炎物質の失活か、投与ミスか、あるいは抗体が古いためにラベルが外れたのか、発色工程に問題があるのか原因が不明です。

このような状況では、さらにどつぼにハマる気がします。
私だったら、ウエスタンでやるなら再度サンプルを用意して固定などせず
そのままサンプルにすると思います。
急がば回れかと。

この回答へのお礼

ありがとうございます。
ウェスタンの分子量は無視したとして、反応性の有無から目的物があるかないかをと思ったのですが、抗体自体がもはや反応しなくなればやるだけ無駄ということもわかります。
おそらく目的物が他の蛋白と一緒に固定され、さらに可溶化自体も難しくなるのかもしれませんね。
もう一度最初から実験を行ってサンプリングを試みてみます。
ありがとうございました。

お礼日時：2008/06/18 10:25