青/白セレクション

　青/白セレクションをして白色のコロニーを選択・培養後、Minipreps（Boiling Method）→電気泳動（0.8% アガロースゲル）をしましたが、目的とするバンドが得られません。
　以前、Competent cell内に目的のplasmid DNAが挿入されなくても白色のコロニーが得られることがあると聞きました。もしそうなら、それはどうしてでしょうか？
　Vector内には抗アンピシリン サイトがあり、バクテリア培養時にはもちろんLBにアンピシリンを加えています。（1μl/1ml・LB）

No.6 ベストアンサー 回答者： pen82 回答日時： 2003/03/14 11:04

申し訳ありません。

RUSASさんのコメントをきちんと読んでませんでした。
補足させていただきます。

950bpだと、普通は、白色のコロニーになるはずですね。しかし、絶対とは言い切れませんので、青のほうも調べてみる価値はあるかもしれません。

白色コロニーなのに外れのものは、ベクターどうしがつながったものかもしれません。確認の時には、何かの制限酵素で切断してから電気泳動をしているのでしょうか？切っているのであれば、その時にベクターが二つに分かれるために、泳動では区別がつかなくなります。また、もし切らずにながしているのでしたら、インサートが入っていても、プラスミドの状態によっては長さの区別がつきにくいかもしれません。

インサートを混ぜずにライゲーションした場合は、どうなっているでしょうか。
ベクターのみを同じ条件でライゲーションした場合と、インサートを入れた場合に違いがあるかどうかを調べると、解決策が見つかるかもしれません。

他には、ライゲーションの前にベクター側をアルカリフォスファターゼ処理することで、セルフライゲーションを防ぐことができます。各メーカーからいろいろ出てますが、私は、ロシュのSAPがおすすめです。

仮定の話ばかりで申し訳ありません。

この回答へのお礼

　回答ありがとうございます。何となく上手くいかない理由が見えてきたような気がします。
　青色のコロニーは一度だけ調べたことがあります。コントロールとして用いたVector、白色のコロニーと同じ位置にバンドが見られました。（＝ No-insertだと考えました。）また、以前、違うDNAの青/白セレクションをした時は青色のコロニーが殆どで、白色のコロニーは一部だったのですが、今回はその逆です。これはそのDNAの性質（？）によるのでしょうけど。
　確認時は制限酵素を用いず、そのまま流しています。プラスミドの状態というのはRing or Linier or Super-coilかということですよね？得られるプラスミドはコントロールとしたVectorと同じ位置にしかみられません。（厳密にいうともう一本Genome Contaminationと思われる12Kb以上のバンドが見られます。因みに目的のバンドの大きさは約3.9Kbです。）
　InsertなしでのLigationはやったことがありません。一度やって比較してみたいと思います。
　また、Vectporのアルカリフォスファターゼ処理もしたことがありません。とりあえずポスドクに提案してみようと思います。

お礼日時：2003/03/14 18:06

No.5 回答者： pen82 回答日時： 2003/03/14 10:44

　青/白セレクションは、かなりあいまいな時があります。

真っ白なコロニーには一切目的のインサートが入ってなく、青のコロニーにはインサートが入っているという事もかなり良くあります。白ばかりでなく、青のコロニーもいくつか調べてみると良いのではないでしょうか。（薄い青から、真っ青までいろいろあると思いますが。）私の経験では、短い断片ほど、青のコロニーがあたりである確率が高くなるように思います。プレート上に、青色のコロニーがたくさんあり、もしこれまで青のコロニーを調べてないのでしたら、一度試してみてください。

　Molecular CloningのChapter 1（149ページ）または、バイオ実験イラストレイテッド　第2巻（70ページ）に、このセレクションが万能ではないということに触れられています。
　

No.4 回答者： beer2003 回答日時： 2003/03/13 23:35

コロニーを選択する際に白色のコロニーをつつき，ベクターに特異的なプライマーが含まれたPCR溶液ですすいでPCR反応を行うという方法

でインサートが含まれているかどうかをチェックしたあとミニプレップでプラスミドを抽出してみてはどうですか？確かpBluescriptだとM13プライマーが使えたと思います．一般的な実験書にも方法が載っていると思いますし，PCR　インサートチェックなどのキーワードでインターネットでも調べることができると思います．

No.3 回答者： poyopoyoyon 回答日時： 2003/03/11 09:53

白色のコロニーを泳動しても目的のバンドが出ない場合はありますよ。

その理由としては、コピー数自体が少ないとか、
セレクションがうまくいっていないことが多いです。
セレクションするとき、完全に白色のコロニーを選んでいますか？
かなり注意して見ないとわからないのですが、白色の中央に
薄く青い点が入ってるコロニーがよくできます。
これは当たりではないので目的のバンドは検出できません。
そして、白いコロニーでもプラスミドのコピー数が少なく
その後の実験には使用できないものも多いですから
とにかくたくさんpick upしてみることです。
私はいつも最低48個はテストしてました。
これでも実際使えるのは半分くらいでした。

この回答へのお礼

　回答ありがとうございました。
　コロニーの選択は注意深くやっているつもりですがひょっとしたら見逃しているのかもしれません。また、培養後plateを＋4℃に4時間ほど置いておくと青色がenhanceされるということをポスドクから聞いたのでそうしています。何れにしても次回はさらに気を付けたいと思います。
　私の場合は毎回24個づつpick upしています。これをかれこれ10回ぐらいは繰り返したと思います。しかし、バンドはコントロール（Vectorのみを流したもの）と同じ位置にしか得られません。本日もそうでした・・。
　濃度は測っていないのですが、電気泳動後の写真ではそれなりにはっきりとバンドが見えているので濃度は低くないと思います。
　もう少し色々と考えながら頑張ってみるつもりです。

お礼日時：2003/03/12 17:52

No.2 回答者： noname#17364 回答日時： 2003/03/10 16:20

こんにちは。

　そういうことでしたら、もうちょっと実験条件を詳しく書いてみてはどうでしょう。
　どういった断片（長さとか、どうやって得られたものかなど）とか、どういった手順でやったのかなど。
　それからバンドが出ないということですが、プラスミドは取れているのですか？ポジコンはおいていますか？

以上のようなことを補足された方がよろしいかと思います。

この回答へのお礼

　回答ありがとうございます。詳しく書きたいと思います。
　Vector（pBluescript）の大きさは約2.9Kb、Insertの大きさは約950bpsです。VectorはXba IでDigestionしています。InsertはPromegaから市販されているphRL-CMV VectorからhRluc というsiteを取り出すためにXba I,Nhe Iを使ってDigestion後、電気泳動→目的のバンドの切り出し→Phenol・Ethanol precipitation→回収したDNAを再度電気泳動をして大きさを確認後Insertとして用いています。
　プラスミドは取れています。しかし、コントロール（Vectorのみを流したもの）と同じ位置（＝No insertと考えていいんですよね？）にしかバンドは見られません。
　もともと、VectorはXba IのみでDigestionしているのに対し、InsertはXba I,Nhe Iを使っているのでLigationされにくいとは思うのですが、それなのに多数の白色のコロニーが得られるのが理解できません。。（むしろ青色のコロニーの方が数が少ないです。）

お礼日時：2003/03/12 17:12

No.1 回答者： Hi104 回答日時： 2003/03/07 22:50

研究室の先輩や先生に聞いてみてはどうでしょうか？ここで質問する内容に思えないのですが。

学生（院生）さんですよね？学生さんなら、聞いても恥ずかしくない質問です。いっぱしの研究者なら、恥ずかしくって聞けないですね。

この回答へのお礼

　こんにちは。
　ご指摘の通りだと思います。実は今現在留学（米国）しています。私が勉強しているlab.のメンバーは自分も含めて4人なのですが、中国人のポスドクは返答に困ると「私に多くは聞かないで！」と言って逃げます。今回も「とにかく白色のコロニーを選んでやればいいのよ。」としか答えてくれません。。（答えになってない・・）ボスはただいま学会＋Vacationで今月末まで戻ってきません。。同じくPh.D.の学生がいるのですが、彼女もよく分からないとのことです。
　同じlab.の人に聞く事が出来れば手っ取り早いのはもちろんなのですが、こういった事情です。事情をお察し下さると幸いです。

お礼日時：2003/03/10 12:06