真核生物のmRNAの多くはコザック配列をもつといわれていますが、もたないものもあるんですよね? 必須というわけではないんですよね? また、コザック配列は開始コドンを含み翻訳開始に関わるそうですが、そうするとNCBIなどのデータベースに登録されている真核生物の遺伝子配列の多くにおいて、上流位置に含まれているということでしょうか?

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A 回答 (2件)

なくても遺伝子発現は見られるので必須ではないと思いますが、


実際にもたないものがあるかどうかはわかりません。

一般に、開始メチオニンをコードするATGの3塩基上流にA/G、
1塩基下流にGというのがコザック配列とされています。
私はACC[ATG]Gというのをよく使いますが、開始メチオニンの
次の塩基に関しては必ずしもGにできないこともあるので、
それほどこだわっていません。

NCBIのデータベースでも多くは確かに上記コザック配列を
持っているような気がします(あくまで私見ですが…)。
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この回答へのお礼

データベースのものも多くはもっている感じなんですね。
自分でも調べてみます!!
経験を聞かせてくださってありがとうございます!

お礼日時:2009/05/21 08:46

http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%B3%E3%82%B6% …
ここになるような感じに私は思っています。

コザック配列があるものでは、その配列の効果があるやつもあるけど、ないやつもある。
そもそも、コザック配列があるやつもあれば、ないやつもある。

といった感じでしょうか・・・。

ちなみに、私が遺伝子を発現させたいときは、おまじない程度にコザック配列を組み込んでいます。効果はあったりなかったりです。
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この回答へのお礼

経験を聞かせてくださってありがとうございます!!
コザック配列の効果はあったりなかったりなんですね!!
ありがとうございました。

お礼日時:2009/05/21 08:43

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Qコザック配列の必要性

実は、あるベクターにc-MycタグをつけてショウジョウバエのS2細胞で発現差背用としているのですが、その際にKozak sequenceは必要でしょうか?
文献等には、Kozak sequenceがあった方が細胞内でのタンパク質の発現レベルが高いとのことが書かれていましたが、実際にどれほどの重要性を占めているのか分かりかねています。
ただ、発現させるだけなら開始コドン(ATG)をつけておけばいいような気もしますが、どうなのでしょうか?
詳しい方がいらっしゃいましたら、ご教授願います。

Aベストアンサー

Kozak配列CCACCaugの中で、augの3塩基前がピリミジンになると翻訳がほぼ完全に起こらなくなるのだと記憶します。

ショウジョウバエではCavener (1987)が翻訳開始のコンセンサスを調査していて、
RNNaugで始まる例が95-98%であるのに対し、
YNNaugは2-5%で全く例外的、しかも
YNNaugYは全くない
という報告をしています。(R=プリン、Y=ピリミジン)
Kozak配列そのものである必要はないかもしれませんが、
YNNaugにしてしまうのは無謀といえるでしょう。

>挿入した遺伝子にもタグがついておらず
タグは発現させるタンパク質fusionにするものだと思いますが、C末端側につければ、入れた遺伝子がもつ本来の翻訳開始がそのまま使われるのでは。

Qpoly-Aとは

poly-Aとはなんでしょうか?
あとpoly-A付加シグナルについても教えてください。

Aベストアンサー

プロセッシングが完了し完成したmRNAの3'末端には、50~200塩基ほどのアデニン(A)ヌクレオチドが付加されています。これがpoly-A tailです。poly-A tailはmRNAに安定性をあたえ、翻訳を促進する働きがあると考えられています。

mRNAは、まず遺伝子のプロモーターからエクソン、イントロンを含め連続的に転写され、転写の終結部は最後のエクソンよりかなり下流に及びます(真核生物では転写終了位置を示すシグナル配列のようなものは見つかっていません)。
この一時転写産物はイントロンを削除しエクソンを連結するスプライシング、5'末端に一個の7-メチルグアノシン(7-m G)を付加(cap構造といいます)するcapping、3'末端にpoly-A tailを付加するpolyadenylationを経て成熟mRNAになります。

poly adenylationは、最終エクソン内のAAUAAAという配列(polyadenylation signal ポリアデニル化シグナル, poly-A additional signal ポリA付加シグナル)を認識するpoly-A polymerase ポリAポリメラーゼによって行われます。この酵素はポリアデニル化シグナルの10~30塩基下流で一時転写産物を切断するとともに、鋳型に依存せずにアデニンを付加します。なお、ポリアデニル化シグナルには例外も知られています。

参考URL:http://opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MGW2/MG234.html

プロセッシングが完了し完成したmRNAの3'末端には、50~200塩基ほどのアデニン(A)ヌクレオチドが付加されています。これがpoly-A tailです。poly-A tailはmRNAに安定性をあたえ、翻訳を促進する働きがあると考えられています。

mRNAは、まず遺伝子のプロモーターからエクソン、イントロンを含め連続的に転写され、転写の終結部は最後のエクソンよりかなり下流に及びます(真核生物では転写終了位置を示すシグナル配列のようなものは見つかっていません)。
この一時転写産物はイントロンを削除しエクソンを連...続きを読む

QShine-Dalgarno配列(S-D配列)って何?

 何もわかってません。一から教えてください。

Aベストアンサー

SD配列は、バクテリア特有の配列ですが、これはmRNAから蛋白を翻訳する際に重要な配列で、開始コドン(DNAではA-T-G)上流の3~15塩基の間に存在する、プリン塩基に富んだ配列(DNAでは-G-G-A-G-G-のような配列)を意味します。これは他の方もおっしゃっている通り、このmRNA上のSD配列の部分がリボゾームに結合し、もうすぐ翻訳開始コドンが現れますのでよろしく!!と挨拶するような配列です。
hiropi-さんは、DNA上にはSD配列が存在しないと言っておられますが、生物の情報はすべてDNA上にあるわけで、tRNAやrRNA等の蛋白情報ももちろんDNA上に存在するわけです。mRNAはまさにDNAの情報をそっくりそのまま転写したもの。したがって、すべての情報はDNA上にあるのでご注意下さい。
またDNAは2本鎖ですが、蛋白の情報を持つ鎖はどちらか一方です。mRNAの塩基配列が示されている場合は、DNA情報鎖はmRNAの鋳型になっているDNAの相補鎖に当たります。(ややこしい?)ですから、mRNAにおけるSD配列は、上記の例の配列の場合,
全く同じ-G-G-A-G-G-なのです。
一部には片方にある種の蛋白の情報を持ち、その相補鎖にその蛋白の合成を制御する蛋白の情報があったりします。まだまだ未知の部分の多い分野ですね。勉強しても追いつきません。

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Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

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(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

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Q蛋白の分子量(kDa)を調べる方法

かなり低レベルな質問なのですが、、、、
分からなくて困っています
約750個のアミノ酸からなる蛋白の分子量を知りたいのですが、どうやって調べたらいいのでしょうか?
よろしくお願いします

Aベストアンサー

アミノ酸配列データがあるなら、計算してくれるソフトウェアがあります。市販の遺伝子解析ソフトウェアには必ずついている機能ですが、ウェブ上でできるサイトもあります。たとえば

http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html

実験的に調べるなら、SDS-PAGE、ゲルカラムクロマトグラフィ、TOF-MASSなど、材料や精度に応じていろいろ方法があります。

QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

QpcDNAっていうベクターつかった事のある方。。。

分子生物初心者でよくわからないんですが・・・
pcDNA3っていう哺乳動物用のベクター、ご存知の方に質問したいのです。

pcDNA3に、発現させたい目的遺伝子を組み込んだ場合、N末ないしC末にtagって付加されますか?
ベクターの構造をみてもさっぱりで;特にtagに関する表記はされてないように思うのです。じゃぁ、発現させた後は、その目的タンパクの抗体で検出するしかないの?と感じています。
それとも、大腸菌用ベクターで予めtag付きで構築して、その付加されたtag部分もろとも切り取って、pcDNA3に組み込んで、tag付きタンパクとして発現させるんでしょうか??

ベクター構築初挑戦?者の質問ですので、表現が変だったらごめんなさい。

Aベストアンサー

目的タンパク質遺伝子のみではタグは付加されないはずです。

もし、タグを付けたい場合はおっしゃっているとおり
タグ付きの配列を入れる必要があります。

別に大腸菌のベクター由来じゃなくても入れることは可能です。ヒスタグの様に短ければプライマー内にヒスタグ配列をデザインすることで簡単に付加できます。それ以外でも制限酵素サイトと含めたプライマーでPCRすることでMCSに遺伝子を導入することが可能です。ただしフレームがずれないように注意する必要があります。

Qプロモーター領域

ある既知のタンパク質遺伝子のプロモーター領域の配列を知りたいというときにはどのように検索すればよろしいのでしょうか。
タンパク質そのものの配列までは調べられたのですが…その後がよくわからなくて。

Aベストアンサー

実験的に同定するのは結構手間です。
まず、転写開始点を正確に決めておく必要があります。
簡便には、5' RACEの産物の端がどこにきてるかで見てもいいと思いますが、完全に伸びきっていない逆転写産物もPCRで増やしてしまうので、多少のあいまいさがでてきます。
正確に決めるには昔ながらのprimer extensionやS1 mappingが必要でしょう。
で、プロモーターは(発現をmodulateするエンハンサーは話が別です)、典型的には転写開始点の-50 bp以内にあります。たとえば、真核生物では、-20 bp 前後にTATA boxまたはGC box、さらに-15 bp くらい上流に-CAATboxとか。そういう典型的な配列があれば、8割がたそこがプロモーターだという蓋然性を言うことができます(かならずしも典型的なプロモーターばかりではありませんが)。
ちゃんと実験的に証明しようとしたら、候補となる領域にレポーター遺伝子をつないで、in vitroやin vivoで転写活性を調べなければならないでしょう。システマティックに欠失シリーズや、点突然変異を作って、どの配列がプロモーター活性に必要十分であるかを明らかにすれば完璧です。

実験的に同定するのは結構手間です。
まず、転写開始点を正確に決めておく必要があります。
簡便には、5' RACEの産物の端がどこにきてるかで見てもいいと思いますが、完全に伸びきっていない逆転写産物もPCRで増やしてしまうので、多少のあいまいさがでてきます。
正確に決めるには昔ながらのprimer extensionやS1 mappingが必要でしょう。
で、プロモーターは(発現をmodulateするエンハンサーは話が別です)、典型的には転写開始点の-50 bp以内にあります。たとえば、真核生物では、-20 bp 前後にTATA boxま...続きを読む

Qアンピシリンの失活温度について

アンピシリンの失活温度について教えてください。

LB(Amp)のプレート培地を作製する時にいつも思うことです。

オートクレーブ後の三角フラスコに入っているLB培地に、いつアンピシリンを添加すればいいのかわかりません。

僕の場合は、三角フラスコをクリーンベンチ内で両手で触って円を描くように揺らしてみて、手をつけてられる熱さまで冷ましてから入れるようにしています。

宜しくお願いします。

Aベストアンサー

私も学部生の頃に同じことを考えましたが。。。結論は結構微妙なところだと思います。アンピシリンは酵素のように高温になると変成していっぺんに失活する訳ではなく、高温になるほど分解の進みが早くなるわけですよね。(もちろん1時間くらい煮沸すればかなり失活するかもしれませんが。。)。というわけで、結局実験的にできるだけ影響が起きない(しかし、ゲルが固まらない)ような妥協点の温度でやるために手で触れる=約60℃で添加することがスタンダードになってるわけです。


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