タンパクの精製について質問があります。

タンパクの精製について質問があります。
GSTタグ融合タンパク質をG-sephaで精製しているのですが、樹脂から溶出されなくて困っています。
タグはThrombinで切り離して、Thrombin処理後にbufferで溶出しています。
bufferには100mM程度の塩が加えられているのですが、どうも樹脂に絡まって出てこないという状況
なので、思い切って500mM～1Mの範囲で、条件を検討してみようかと思っています。
塩濃度を上げすぎるとタンパクに良くない（変性する）などの問題が出てくるでしょうか。
また、1Mの塩が入っているbufferで溶出しても後に透析などで塩を除けば大丈夫なものなのでしょうか。

また、塩で溶出した場合、Thrombinで切断されずに残ったGST融合タンパクがタグ付きで出て来てしまう、切断はされたものの、GSTタグだけのものもG-sephaとの相互作用が弱くなって出てきてしまう、などのトラブルはありえますか。
素人なので良くわかりません。
どなたか経験者の方、ご教授よろしくお願いします。

No.1 ベストアンサー 回答者： sewingcough 回答日時： 2010/06/20 12:43

> 思い切って500mM～1Mの範囲で、条件を検討してみようかと思っています。

> 塩濃度を上げすぎるとタンパクに良くない（変性する）などの
> 問題が出てくるでしょうか。
タンパク質によるのでなんとも言えませんが、
タンパク質によっては沈殿してしまうことがありますが、
塩濃度の低い条件で沈殿しているならば溶出する可能性もあります。
貴重なサンプルでしたら、100uL程度の樹脂をエッペンに移して
遠心＆SDS-PAGEで溶出条件をテストしてみたらいかがでしょうか？
あと、ちゃんと切断反応が進んだ事は確認しましたよね？
切断がいってて溶出してこないなら、封入体になってるんでしょうね。

> また、1Mの塩が入っているbufferで溶出しても後に透析などで
> 塩を除けば大丈夫なものなのでしょうか。
沈殿してなければ大丈夫です。
ただし透析前後で塩濃度が大きく違っているので、
複数回透析バッファを交換して念入りにした方がいいです。
また、溶出バッファで沈殿するならば、
透析で同じ様な条件に戻せば沈殿する可能性はあります。

> また、塩で溶出した場合、Thrombinで切断されずに残ったGST融合タンパクが
> タグ付きで出て来てしまう、切断はされたものの、
> GSTタグだけのものもG-sephaとの相互作用が弱くなって出てきてしまう、
> などのトラブルはありえますか。
GSTについてはおそらく大丈夫ですが、
もし結合後に1M塩バッファで樹脂を洗浄していないならば
多少は欲しいタンパク質以外のタンパク質も溶出されてくるでしょう。
普通は溶出バッファに近い条件で洗浄するので問題になりにくいですが、
今回の場合洗浄と溶出でバッファ条件が大きく違うので仕方ありません。
（私の場合は切断前の時点でなるべく綺麗にしておきたいので、
普段から界面活性剤や1M塩で軽く洗浄するようにしています。）

この回答への補足

>もし結合後に1M塩バッファで樹脂を洗浄していないならば
多少は欲しいタンパク質以外のタンパク質も溶出されてくるでしょう。

1Mの塩でWashというのはやったことがないのですが、1MでWashしてもG-sephaとGSTタグの相互作用
には影響がない、ということですよね？
自分の研究室では、塩は高くても300mM程度でしかWash bufferに入っていないので、これではWashの意味がないと考えた方が良いですか？

補足日時：2010/06/24 14:56