酵素の精製

DEAE-クロマトグラフィーで粗酵素液を精製しました。そして、ある特定の酵素を精製して取り出しました。でもまだその酵素以外にもまだいろいろ混ざっているということでさらに精製する必要があるんだと思います。そのように更に精製を進めるためにはどんな方法が有効とされますか？まさかもう一度DEAE-クロマトグラフィーで精製するのですか??　
また、（粗酵素液流入後）なぜNaCｌの濃度の違う緩衝液をその陰イオン交換体カラムにNaCｌ濃度の低い順に流しいれていったのかよくわかりません。

No.1 回答者： takakokoreo 回答日時： 2004/11/08 18:23

もう一度DEAEで精製することが有効な場合もあります．

構造が壊れてもいいなら，電気泳動で分けることも出来ます．


どんなタンパク質を，何のために精製するのでしょうか？それがわからないと，回答は難しいですね（分かっても難しいですね）．

タンパク質の精製は難しく，一般的なことがなかなか言えません．参考ＵＲＬの本は参考になると思います．

参考URL：http://www.amazon.co.jp/exec/obidos/ASIN/0387940 …

No.2 回答者： nitscape 回答日時： 2004/11/08 18:24

＞精製を進めるためにはどんな方法が有効とされますか？

酵素や精製度によって異なります。精製が進んでいるのでしたらゲルろ過辺りがいいと思います。


＞まさかもう一度DEAE-クロマトグラフィーで精製するのですか??
一度流したときの精製度によっても異なりますが、粗酵素液からの2度目でしたら有効です。

＞NaCｌ濃度の低い順に流しいれていったのかよくわかりません。
簡単に言うなら徐々に溶出させるためです。この辺は精製の超基礎的な事項です。酵素を精製するのでしたら実験を行う前に勉強しておくべきことだと思います。

No.3 ベストアンサー 回答者： Kohntarkosz 回答日時： 2004/11/08 18:45

全てのタンパク質の分子量、電荷、疎水度、生理活性、科学的結合性において互いに異なるので、

それぞれに着目した方法で分離することができます。
一つの方法だけでは目的とするタンパク質のみを分離することは難しいので、
通常は複数の方法を組み合わせて精製を行います。

陰イオン交換クロマトであるDEAEを使っているので、
１）DEAEとの吸着条件を変えてもう一度クロマトをかけてみる（pHを少し変えてみるなど）
２）CMなど陽イオン交換カラムを試す
３）ゲルろ過する
４）その他の方法（疎水性クロマト、ハイドロキシアパタイト、電気泳動）を試す
などが考えられます。どれも予備実験をしっかりする必要があります。

DEAEなどのイオン交換クロマトグラフィは、まず、タンパク質がイオン交換基に結合するものと
しないものを分別します。
結合しなかったものはそのまま溶出され、結合した物はカラム内にとどまります。
この結合したタンパク質は、平衡緩衝液中の塩濃度が上がるとともに、
結合能が低い分子から順に溶出されてきます。
NaClを徐々に濃くしていくのは、吸着したタンパク質をさらに分画していくためなのです。

タンパク質精製についての詳細は実験書（羊土社などで出版されている）などを見てください。
もちろん、経験者に直接聞くのがベストです。

つたない文章ですみませんが、理解の一助になれば幸いです。

この回答への補足

丁寧な解答ありがとうございます。
まだ、基礎的なことしか習っていないので、もうひとつ初歩的な質問をさせていただきます。たとえば精製して酵素Aを得たいとき→収率が１００％から精製後３６％になったということは、６４％の酵素Aは失活などで得ることができなく、よって３６％のAだけ得たということですか？収率は精製後、酵素Aがどれだけになったかを示しているのですか？

補足日時：2004/11/09 11:01

No.4 回答者： mizu_atsu 回答日時： 2004/11/08 21:32

既に精製を始めているということは

研究室に入って実験しているということです。
ならば文献を読んでください。
同じような酵素を精製しているものならかなり参考になるはずです。
同じようなものがないとしても酵素精製に関するものなら参考になるはずです。

一般的には他の方が答えておられるように
他の種類のカラムを通すことになります。
どのカラムを使うかは現時点での精製度によります。
もし、目的の酵素と同じくらいのタンパクがなければ
ゲルろ過だと思いますし、そうでなければ陽イオン交換などが有効なように思います。

なお、基本的な理論もわからず実験しても効果は半減です。
うまく行かなかったときにどうすれば改善できるとかがわからないからです。
やる前に多少なりとも勉強することを強く勧めます。
それが結果として近道になるはずです。

No.5 回答者： chicago911 回答日時： 2004/11/09 00:47

回答は既に出ているようです。

重複しますが、実験作業を行なうときはその意味、Mechanism を事前に考えておくことは最低限必要です。また、目的物質の Character を調べておくことも同じように重要です。

参考 URL から入り、問題の酵素名で文献検索をまず行ない、それを読めば、未知の酵素を精製、Characterization するのでなければ、解答 (回答ではありません、この違いはわかりますね) が得られます。

参考URL：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi