プロモーター解析

全くの素人です。遺伝子工学ハンドブックを購入しだいそちらも参考にしますが、今はまだないので教えていただければと思います。

レポーター遺伝子つきのベクターに調節領域を挿入して対象細胞での発現を見る方法は分かったのですが、その他の方法で混乱してしまいました。S1マッピングという方法がありますが、参考書の図を見ても理解できませんでした。これは、プロモーター領域を含む5'プローブでmRNAとハイブリダイズさせた後、S1で切ってハイブリダイズした部分だけを電気泳動しているようですが、プローブをDNA上の調節領域とmRNAコード配列の境界となるように設計して、電気泳動でのサイズからその部位（転写開始点やスプライス部位など）を調べるということで良いのでしょうか？この場合は当然転写調節の標的となるmRNAを用いると思いますが、レポーターアッセイの場合はこのmRNAがGFPやルシフェラーゼになっている訳ですよね？
　また電気泳動でサイズが分かったら、標的調節領域に変異を導入して詳しい機能を調べるという手順でしょうか？

実験せずに想像で書いていますので、誤りを指摘して下さると助かります。

No.2 ベストアンサー 回答者： geneticist12 回答日時： 2005/06/07 20:47

5'RACEでRNAの5'末端を決めるという考え方もありますが、PCRをかませると、5'まで伸びきっていないRT産物も、伸びきったものと同じくらい増幅されてきますので、検出される末端の位置にかなりゆらぎが生じます。

RNAから逆転写した産物をダイレクトに見るprimer extensionは、伸びきったところで止まる産物が最も多く、シグナルが一番強くなるので、そういう問題は起こりにくいです。

この回答へのお礼

大変参考になりました。

primer extensionはRACEのようにcDNAの3'末端にアンカーをつけてPCRするわけではないので、5'からの伸長によって転写開始点に達しやすいことがわかりました。実際やってみないと覚えにくいようにも思いますが、今後も質問する際にお世話になるかもしれません。ありがとうございました。

お礼日時：2005/06/07 23:19

No.1 回答者： geneticist12 回答日時： 2005/06/07 07:50

S1マッピングは転写開始点を正確に決めるために行うものであって（エクソン、イントロンを決めるのにも使われていましたが、今ではRT-PCRなどでより簡単に調べられるようになったので、この目的で使われることはまずありません）、レポーターアッセイとは目的が違います。

S1マッピングのほかに、primer extensionという方法もポピュラーです。いずれの場合も、シークエンスラダーと並べて泳動することによって、一塩基単位でRNAの5'末端がゲノムDNAのどこにあたるかを決めることができます。プロモータアッセイは、転写開始点から上流をターゲットにするので、転写開始点を正確に決めてからはじめるのが定石です。

この回答へのお礼

早速のご回答ありがとうございました。

＞シークエンスラダーと並べて泳動することによって、一塩基単位でRNAの5'末端がゲノムDNAのどこにあたるかを決めることができます

なるほど、正確に決定することが分かりました。
プライマー伸長法の場合も転写されたmRNAをプローブつきのDNAに置き換えて電気泳動しているようですが、考え方としてはRT-PCRに良く似ているように思いました。違うのはプライマーぐらいでしょうか？それともまったくの別物なのでしょうか？

お礼日時：2005/06/07 15:37