No.2ベストアンサー
- 回答日時:
まず,質問者さんがやった実験の目的は何なのでしょうか。
もしかして,至適温度や至適pHを求めるものではなかったのでしょうか。それなら操作が完全ならば結果を信ずるべきです。酵素の至適温度や至適pHは,どの生物由来のどの酵素かにより様々です。本当に37℃,pH7.3のβ‐ガラクトシダーゼなのでしょうか。ご質問者さんは大腸菌由来と言っていますが,下記URLにもありますようにβ‐ガラクトシダーゼは,必ずしも37℃,pH7.3ではありません。
一般的な話をしますが,酵素の至適温度は1℃~100℃ほどです。南極海の浅海の温度は1℃です。そこに生息する独特の生物の酵素の至適温度は1℃です。わずか2~3℃の温度上昇でそれらの酵素は失活します。また,PCRの酵素は耐熱細菌のものを利用しています。これらは100℃を越えても失活しませんよね。
もう一度初めから検討されることをお勧めします。参考になりましたなら…
参考URL:http://www.amano-enzyme.co.jp/pdf/food_j/cat_foo …
返事本当に有り難うございます。実験の目的は酵素の基質特異性を調べるためのものです。そのために一番活性の高いpHの緩衝液を調べるために行いました。その結果活性が最もずば抜けたのはpH6~7付近でした。しかし文献値は至適pH7.3~7.6と描いていたのですが、pH6に最も活性が出てきたので、どうしてなんだろうとかんがえていました。
もう一度理由を考えて見ます。ちなみにβ‐ガラクトシダーゼは大腸菌由来のものです。
No.4
- 回答日時:
前も書きましたが至適pHは反応条件によって変わってきます。
文献の酵素と同じ条件でやっているのでしょうか?
またガラクトシダーゼにも様々ありどれもが同じ至適pHを出すとは限りません。
さらに加えた酵素もバッファーに入っているはずでこの量が多かったりすると
反応液自体のpHも怪しくなってきます。
なお♯1さんも書いていますが
温度は反応前に一定にしておく必要があります。
なんか酵素と基質をいれてから37度なら37度の恒温槽に入れているようにみれます。
また実験で室温ってなんですか?
20度とかそういうきちっと管理していないと意味ないですよ。
No.3
- 回答日時:
理由を考える前に実験の再現性を見るのが先かと思うのですが…?
この実験は1条件につき1サンプルで一度しかしていないのですか?だとすれば学生実験でしょうか?その場合他の人との結果の比較などはしてみましたか?
再現性の確認が出来ないとなると、緩衝液の作製間違いやサンプルの取り違いなどかなりの原因が考えられすぎてひとつに絞りきれないですよ(^^;
No.1
- 回答日時:
こんにちは
繰り返すようで恐縮ですが、通常至適pHを検討するときには基質・バッファを所定の温度にしておき、酵素を加え、一定時間作用させて加熱などで酵素反応を停止し、PNPGの場合でしたら比色というステップになると思います。
至適pHは多くの場合、前後よりも高いピークのところで示されますが、ご質問を拝見しているとpH6のところにしか活性がなかったという風に読みとれ、またpH7.3に持っていく前段階でpH6を通過するような記述であって「どんな実験方法なんだろう?」と感じます。
これと酵素の失活をからめるのは少しおかしい気がします。
私なら、そのような結論を導くまえに、実験の再現性があるかどうか、酵素をバッファとともにインキュベートしてから活性をはかる、あるいは特定のpHでの保存安定性を検討すると思います。
なお、おせっかいながら前の質問を締め切られてから次の質問に移られる方が混乱しなくて良いのでは?と思いました。
ありがとうございます。活性はpH6~7の付近で活性がありました。実験方法はpHの異なる5種類の緩衝液に酵素と基質をいれ、37℃。50℃、室温の3種類で20分加熱し、その吸光度を測定しました。このとき他の緩衝液は低い吸光度であったのですが、pH6が飛びぬけて高く、その次にちょっとだけ下がってpH7が高かったのです。
文献には至適pHが7.3ぐらいと書いていたので、なぜその通りにならないのかと悩んでいました。もうちょっと考えて見ます。有り難うございました。
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