PAGEについて

最近PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)をやり始めたのですが、
泳動結果が安定せず、実験ごとにバンドがきれいに見えたり、バンドが
広がって見えてしまったりします。原因として何が考えられるでしょうか？

ポリアクリルアミドゲルを作成するにあたっていろいろな本を参考にしましたが、
TEMEDの量や、10％APSの量が本によってバラバラでどの量を信じていいのかも
わかりません。もし、実際にPAGEを経験された方がいらっしゃればコツを
おしえていただけないでしょうか。

私が行なっているPAGEはゲル濃度５％、非変性です。

よろしく御願い致します。

No.6 ベストアンサー 回答者： courreges 回答日時： 2001/11/06 02:31

なるほどミューピッドでPAGEですか．（よく見ればすでに書いてありましたね．ちゃんと読んでなくてすみません．）たしかにあまり聞かないですができないことはないと思います．プレキャストゲルも売っているぐらいですから．しかし，ミューピッドで行っているとすると私の回答は的外れでした．ますます，すみません．

さて，他の方への補足を読んでの回答ですが，電圧は低めの方がきれいに流れます．というよりもゲルの温度を低く一定に保つことが重要です．ただしミューピッド型ならばバッファに完全に浸かっているでしょうから温度の上昇はある程度抑えられますよね．

脱気についてですが，私の経験ではシークエンシングやSSCPでもないかぎり，通常の電気泳動では脱気は不要です．kazu-uraさんが書いているように静かに混和すれば十分です．


ところで横型の場合，ゲルはどのように作るんですか？スラブ型でしか行ったことがないのでピンと来なくて．ウェル以外の部分を空気から遮断するための専用の器具があるんでしょうか？（回答欄での質問で申し訳ないんですが後学のために．^ ^;）

この回答への補足

度々回答ありがとうございます。すいません、何度も。

そうなんですか、脱気は特に必要ないんですか。ありがとうございます。
脱気について気になっていたので、良かったです。

＞ところで横型の場合，ゲルはどのように作るんですか？スラブ型でしか行ったこ＞とがないのでピンと来なくて．ウェル以外の部分を空気から遮断するための専用＞の器具があるんでしょうか？

ウェルを作るためのコームの部分だけ穴が開いているカバーを被せてゲルを作成します。これで、一応空気から遮断されることになっていると思います。

補足日時：2001/11/06 10:09

No.5 回答者： kexe 回答日時： 2001/11/05 16:24

補足のほう見ました。

返答遅くなってすいません。

>ゲル作りに関してですが、TEMEDとAPSの量はどちらを調整すればいいのでしょうか？
>両方ですか？それとも片方の量をふやすのでしょうか？

両方です。うちの場合60mlくらいの溶液を作るのであれば
１０％ＡＰＳを２００μL、TEMEDが６０μLくらいだったと思います
ゲル濃度を下げる場合にはこれらの量を両方とも減らせばよいと思います

またＡＰＳですがうちの場合１０％ＡＰＳをあらかじめ作っておき
エッペンなどに分注し、冷凍庫にて保存しています。

私もタンパクを対象に行っているのでＤＮＡの泳動に関しては
すいませんがわかりません

あとcourregesさんもおっしゃっていますが
ウェルをよく洗う、これは泳動に用いるバッファを使い洗ってください
またゲルを装置にくっつけ、泳動用バッファーをいれた後に
サンプルを静かにいれてあげていますでしょうか？

参考URL：http://www.biochem2.m.u-tokyo.ac.jp/web/contents …

この回答への補足

度々ありがとうございます。

TEMED、APSの件ありがとうございます。早速やってみます。

みなさんが使ってらっしゃる泳動装置はやはりスラブ型？というのでしょうか？
縦型のものがほとんどなのでしょうか？私が使っているものは他の方の補足に
書かせていただきましたが、ミューピッドという横型のものです。これでは
良い結果がえられないのでしょうか？

あと、愚問かもしれませんが、脱気は絶対に必要なのでしょうか？私は今、
脱気は行なっていません。これが原因なのでしょうか？

補足日時：2001/11/05 22:27

No.4 回答者： courreges 回答日時： 2001/11/04 00:14

AGEではっきり見えるサンプルのバンドがPAGEでははっきりしないというのは不思議です．PAGEは決して難しいものではありません．私がPAGEでサンプルを綺麗に流すためにAGEのときよりも注意している点は3つです．

１．アプライ直前にウェルをよく洗う
２．アプライするサンプルのボリュームをなるべく少なくする
３．アプライ後のウェル底面からのサンプルの厚みを薄くする

２についてですが例えば500 ngのDNAを5 μlとして流したほうが10 μlで流すよりもバンドはシャープになります．DNAはゲルに入った瞬間から分離されていきます．サンプルボリュームが大きいとサンプル中のすべてのDNAがゲルに入るのに時間がかかり後から入ったDNAがスミアになったり泳動が遅れたりします．

３についても同様です．私はゲル厚よりも細いマイクロシリンジもしくはシークエンスゲル用のチップを用い底の方からなるべくコンパクトにアプライしています．仮に通常のチップを使いウェルの上から（AGEの時のように）流し込むと泳動像は乱れます．

もう一つ重要なことはDNA量で，ADEMUさんやkazu-uraさんも記載している通りです．AGEでバンドが確認できる量の1/5から1/10に減らしてもPAGEならきれいに見えると思います．

ちなみに分離したいDNAのサイズは適切ですよね？

この回答への補足

回答ありがとうございます。

サンプル量ですが、AGEと同じようなサンプル量をPAGEの時にも
流していました。量を減らして実験してみます。

＞仮に通常のチップを使いウェルの上から（AGEの時のように）流し込むと泳動像は＞乱れます．
私が使っている電気泳動装置はミューピッドというもので、PAGEの時もAGEと同様に上からピペットを使ってサンプルを流しこんでいます。このようなやり方では
きれいな像を得ることはできないのでしょうか？

補足日時：2001/11/05 22:18

No.3 回答者： kazu-ura 回答日時： 2001/11/03 13:39

私はwestern blotのためタンパクをSDS-PAGEで流しているので参考になるかはわかりませんが、

サンプルを流すときにDNAマーカー(HaeIIIや250 bp ladder)を流していないのでしょうか？
もし、マーカーは一定して出ているのならサンプルの問題と思います
１、サンプル量が多いあるいは少ない（容量、濃度）
２、サンプルとサンプルバッファーのグリセロールと均等に混ざっているか？
３、ウェルの底にきれいにサンプルがアプライできているか？
この2つはサンプルバッファーにBPBが入っていれば判ると思います。
４、サンプルに熱をかけていないですよね

もしマーカーも変ならゲル、泳動条件、EtBrの問題とおもいます
１、ゲルはガラスで挟まれた1mm厚のものか、ミューピッドで使う5mm程の厚のものか、後者ならゲルが厚い分バンドがブロードになり、染色の時間もながくなる、その分バックも高くなります。またゲルを作るにも空気が入りやすくなり均等に固まりにくいかもしれません。これまで回答された方々も書かれてますが、毎回できるだけ同じ条件のバッファーを使うことも大事でしょう。ゲル作りに必要なものでAPSは用事調整、TEMEDは市販の瓶から、ポリアクリルアミド、ビス混液は遮光冷蔵で3ヶ月程度はもつと思います。水、バッファー、ポリアクリルアミド、ビス混液を加え混ぜ、脱気、その後APS、TEMEDを静かに加え、空気が混ざらないようように混ぜる、そのあと型に静かに流します。1時間くらいで固まります。
２、泳動条件ですが、私は自作ゲル(7.5、10、15%対照タンパクにより）1mm厚、10cmX10cmで濃縮ゲル50V40-50分、分離ゲル100V60-90min定電圧で流しています。市販のゲル（マルチゲル、第一科学）も使ったことがありますが、説明書どおり定電流で流すと1時間もかかりませんが、泳動バッファーが非常に熱くなる、バンドがきたない、ゲルの大きさが大きく扱いにくいで、今は面倒ですが自作です。
３、EtBrの染色ですが時間をかけず、泳動後短時間で行ってください（ご存知だとおもいますが）。

マーカーを流した結果がわからないのではっきりココといえませんが、今のところこんなもんです。APS、TEMEDの濃度は月曜職場にいけばわかりますが、タンパク用です。

この回答への補足

回答ありがとうございます。

私がゲル作成と電気泳動に使っているのはミューピッドなのですが、
ミューピッドでもきれいなバンドが得られるのでしょうか？
ミューピッドのように横に電気泳動するPAGEはどの本を見ても無く
不安です。また、ミューピッドの場合50Vと100Vが設定できますが、
50Vで泳動を行ったほうが美しいバンドが見られるというようなことは
あるのでしょうか？

補足日時：2001/11/05 22:11

No.2 回答者： ADEMU 回答日時： 2001/11/01 19:44

私もＰＡＧＥは初心者なんですが、最初は自分でゲルを作っていましたがどうもバックグランドが高くて困って市販のものを使用しています。

注意点として、ＡＰＳはなるべく用事調製のほうが良い。
サンプルコームはまっすぐ抜くこと。もし曲がっている時は針などでまっすぐにする。
適正な量をアプライする。（先に蛋白量を量っておく）
確認なんですが染色には問題ないのですか。また、試薬は当然毎回同じ濃度のものを使っていますか。条件が違うと当然結果もばらばらになると思います。
私も同類と思いますのでそれほどアドバイスはできませんが、こんなもんで勘弁して下さい。

この回答への補足

回答ありがとうございます。

私が行なっているPAGEはDNAを流しているのですが、染色には
エチジウムブロマイドを使っています。
アガロースゲルより解像度が高いと聞いてPAGEを行なっています。
アガロースではくっきりとバンドが見えるサンプルでも、ポリアクリルアミド
だとはっきり見えないんです・・・

補足日時：2001/11/01 20:11

No.1 回答者： kexe 回答日時： 2001/11/01 19:31

今卒業研究で2D-PAGEを行ってます。

泳動結果が安定しないという事ですが
フロントラインがくずれるのであれば電流が高すぎ、
広がって見えるときには隣のレーンに何も入れていないのが原因
サンプルと同じバッファーを等量ながしてあげてください
またサンプルへDNAやRNAなどの不純物が含まれている場合にも同様です
アセトン沈殿などを試して見てはいかがでしょう

またゲル作り（TEMED、APS）に関しては
あまり早く固まりすぎるとゲルが均一にならないのでだめです
固まるまでに３０分以上かかるように調節するといいと思います

あとアクリルアミドを加えた後はあまり激しくかき混ぜると
目には見えませんが気泡が入るらしくパターンがみだれます

これくらいでいかがでしょうか

この回答への補足

回答ありがとうございます。

ゲル作りに関してですが、TEMEDとAPSの量はどちらを調整すればいいのでしょうか？両方ですか？それとも片方の量をふやすのでしょうか？

>あとアクリルアミドを加えた後はあまり激しくかき混ぜると
>目には見えませんが気泡が入るらしくパターンがみだれます
これは知りませんでした。一生懸命かき混ぜていました。試してみます。
ありがとうございました。

補足日時：2001/11/01 20:06