はじめまして、とても困っているのでよろしくお願いします。
私はある蛋白の抗原決定基を調べるために、酵素で分解しながら市販のモノクローナル抗体を用いてイムノブロットを繰り返し行い、ある程度絞れたら(小さい断片になったところで)アミノ酸シーケンスを行なう予定でいます。そこで質問です。

質問:ある蛋白xが抗原決定基を一つ以上持つ場合(たとえば三ヶ所)、モノクローナル抗体ではこのうちの一ヶ所にしか反応しないということでいいんでしょうか? また、三ヶ所のうちどれに反応するかはモノクローナル抗体次第ということでしょうか?逆に動物に免疫したポリクローナル抗体では三ヶ所それぞれに反応する抗体が存在し得るということなんでしょうか?
 また大きなタンパク質になるほど抗原決定基は増えると考えていいんでしょうか?

なんだか支離滅裂な文章で申し訳ありませんがよろしくお願いします。

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A 回答 (5件)

「市販のモノクローナル抗体」とあったものについてですが、その抗体に関する参考文献は網羅されているのでしょうか?


今お使いのモノクローナル抗体では、詳細な認識アミノ酸配列について述べられている資料はあるのでしょうか?

中にはもちろんどういった部分を認識しているか(アミノ酸配列だけでなく、その部分のリン酸化等による修飾形態等によっても結合が左右されるため)が分からないものも、市販の抗体には当然存在します。
koolashさんが行っておられる実験は、このような認識部位不明のモノクローナル抗体について、それが認識している具体的なアミノ酸配列について追求されておられるのでしょうか?

そうなると、話は別になってきますが、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体に関する抗原認識の機構は先のすべての回答に要約されています。

具体的にどういった目的でそのモノクローナル抗体を使用されているのか、そのモノクローナル抗体についてのペーパーでその抗体の性質がどの程度まで解明されているのか、が分かれば早いのですが、なにせ研究ですので詳細は明かせなくて当たり前ですよね。

モノクローナル抗体も、アミノ酸の一次構造のみを単純に認識しているわけでもなく、その配列内における修飾状況、またそれに付随した立体構造の変化により反応性は変わってしまいます(私もやっかいな抗体を扱っていた経験があり、過去にこのサイトでえんえんと他の回答者の方々に相談にのっていただきました。気の遠くなるような討論ですが、参考URLを一度見てみてください)。

この質問内容のみでしたら、一般的な抗体の性質の言及のみに留まってしまいますので、koolashさんの求めていらっしゃる回答にならないのかも知れませんね。一応、モノクローナル抗体についての過去の質問の紹介もしておきます。でもakiyamaharukaさんのご紹介されたURLの方が参考になるでしょうね…。http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=156226

そういった訳ですので、koolashさんが今困っていらっしゃる点について、もう少し補足可能なようでしたら、まだ私を含め他の専門家の方々の助言がいただけるかも知れません。

もしまだどこか引っ掛かることがあるようでしたら、新たにご質問されるか、補足にてお知らせください。

参考URL:http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=80000
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市販のモノクローナル抗体をお使いと言うことは、そのモノクローナル抗体が認識するアミノ酸配列が明らかのはずですよね。



検討されている蛋白をどの程度の長さまで切断されるのか分かりませんが、もしその蛋白の中でモノクローナル抗体がクロスリアクションを起こしやすい程度の非常に酷似している配列を有している場合で、その部分が酵素によって途中で寸断されることなく切断された場合は、そのウェスタンブロッティングで複数のバンドが検出されてしまう可能性はあります。
しかし、そういったケースは私自身それほど多岐の分野にわたるペーパーをチェックしている訳ではありませんが、見かけたことはありません。
モノクローナル抗体はものによってそれぞれですが、短いアミノ酸配列(10個以下)では、ひょっとするとあり得るのかも知れません。ですが、ターゲットに厳密に反応するように作製されているはずですから、あまり経験しないのでしょう。

ポリクローナル抗体は、(おわかりでしょうけど)色々な配列部分を認識する様々な抗体が混在するものです。その抗原決定基は重複する場合、あるいは一つの抗体認識部位の全体を覆うような配列部分を認識する場合等がもちろんあります。当然、配列が長くなればなるほど、それだけ抗体が産生されうる抗原決定基の種類(言い方は少し不適当な気もするのですが)も増えるでしょう。

どこまで蛋白の大きさを絞り込むのか分かりませんが、一度壁にぶち当たるまでトライしてみてからまた同一蛋白の他の抗原決定基を認識するモノクローナル(あるいはポリクローナル)抗体での反応をチェックするといった感じでもいいとは思います。

私も支離滅裂な回答になりましたが、どうでしょう?

この回答への補足

>市販のモノクローナル抗体をお使いと言うことは、そのモノクローナル抗体が認識するアミノ酸配列が明らかのはずですよね。

ということなんですが、これは合成ペプチドを抗原としてモノクローナル抗体を作ったということですか?
 使用しているモノクローナル抗体はakiyamaharukaさんの参考URLにあるような方法で作られたものだと思うのですが、このような方法で作られた抗体でも認識するアミノ酸配列はわかっているんでしょうか?

度々申し訳ありませんが、教えてください。
 

補足日時:2001/12/04 11:58
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>ある蛋白xが抗原決定基を一つ以上持つ場合(たとえば三ヶ所)、モノクローナル抗体ではこのうちの一ヶ所にしか反応しないということでいいんでしょうか?



その一つにしか反応しない抗体のみを産生する細胞からとったものがモノクロですからそうなります。ただし、繰り返し配列があり、同じ部位を2カ所以上持てばすべてで反応します。

>三ヶ所のうちどれに反応するかはモノクローナル抗体次第ということでしょうか?

どこが抗原決定基かどうかで決まるわけですから。

>逆に動物に免疫したポリクローナル抗体では三ヶ所それぞれに反応する抗体が存在し得るということなんでしょうか?

そういうことです。しかし部位によってエピトープになりやすさが違うのでポピュレーションの割合が同じではありません。
例えば、免沈できる場所のもの、免染しやすい場所のもの、ウエスタンにはすごく強いものとあるわけです。これは免液の度に違うものができるわけです。

ここでいう、抗体ができにくいエピトープだとしても、
モノクロならばそれがとれれば後は増やせばいいから強いわけです。
ただし手間はかかります。

またモノクロでは、生物種が違う場合、異種でエピトープの配列が違うと認識しないということがおこるわけです。その点どこかに同じエピトープがあればよいモノクロは強いですよね。またエピトープが糖を含む場合、ネイティブには反応するがリコンビナントではさっぱりなんてこともあります。

すこし話がそれましたが、モノクロの作り方の理解が少々不足と感じます。
お勉強がんばってください。

参考ページでちょうど3つのエピトープの話で説明があります。

参考URL:http://www.jpo.go.jp/ryutu/map/kagaku10/2/2-4-1. …
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モノクローナル抗体は抗原の特異性を高めたもので抗原の特長を最小限のアミノ酸で認識しています。


ポリクローナル抗体は抗原の類似性を認識できず特異性が低く、アミノ酸を幅広く認識しています。
質問にある蛋白は抗原決定基を複数持っていますが、モノクローナル抗体は当然1ヶ所認識します。サンドイッチ法では異なった2種類のモノクローナルを使用します。もし3ヶ所あるとすればその3ヶ所のうちその蛋白をより特異性の高いものにする部位を選べばモノクローナル抗体として試薬として使用できます。
ポリクローナル抗体は認識できるアミノ酸が幅広いため分子量の少ないものはあまり特異性が高くありません。3ヶ所それぞれといういみではなく、3ヶ所の抗原決定基をそれぞれ幅広く認識しているということでそのアミノ酸に類似したものをみんなつかまえてしまうということです。
蛋白質が大きくなるにつれ抗原決定基は増えますが、反対に類似性をもつものも増えると思います。
なんだか支離滅裂な答えになってしまいました。
ご理解いただけたでしょうか。
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あまり、詳しくありませんので


間違っていたら、ごめんなさい。
でも、正しいと信じて回答します。

モノクローナル抗体のクロスリアクションも
関係有るのでこれがないと考えると
モノクローナル抗体は1つの抗原決定基しか認識
しないはずです。でも、抗原蛋白には、同じ抗原決定基が
いくつも存在する蛋白もあるかもしれません。

動物に免疫したポリクロでは、かなりの確率で3つの抗原
決定基に反応する抗血清が取れると思います。

分子量が小さいと抗原性が低いですから、
大きな蛋白ほど抗原決定基が増えるという考え方は
ある意味で正しいのではないかと思います。

答えになっているかどうか判りませんが
素人なりに回答させてもらいました。
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Qモノクローナル抗体と、ポリクローナル抗体

両者の抗体価や使用目的の違いはどんなでしょうか?大学で学ばれた方、是非お願いします。できれば製造法の違いも教えてください。

Aベストアンサー

何度かこのような質問で過去に回答させて頂きました。
説明はそこに書かれていますので、一度ご覧ください。

http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=156226

http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=179178

参考URL:http://oshiete1.goo.ne.jp/kotaeru.php3?q=156226

Qモノクローナル抗体

モノクローナル抗体はどのようなことに利用したくて、
生産されるようになったのですか?

Aベストアンサー

抗原には多数の抗原決定基(エピトープ)が存在します。ポリクローナル抗体は、ある抗原のこれら複数のエピトープ(例えば抗原蛋白の数カ所のアミノ酸配列部分)を認識します。つまりこれはポリクローナル抗体が含まれる血清中には、その標的蛋白抗原の「a」というエピトープを認識する抗a抗体、「b」というエピトープを認識する抗b抗体、「c」というエピトープを認識する抗c抗体…、がブレンドされた状態で存在するためです。(生体内における免疫で、同様の現象が起こっています)
従って、このポリクローナル抗体での抗原抗体反応は、標的蛋白抗原と反応する以外に、その抗原と一部類似の配列を持つような抗原蛋白に対して交差反応を示す可能性があります。また、この標的蛋白に対するそれぞれの抗体はどの免疫動物の個体でも毎回同じ比率で産生されるとは限りません。

これに対し、モノクローナル抗体は、単一のエピトープを持った抗原(例えばそれほど長くない合成ペプチド)で動物を免疫し、厳密にこのエピトープを認識する抗体(例えば抗a抗体)を産生している抗体産生細胞を探し出し、これとミエローマ細胞とのハイブリドーマ(融合細胞)を作製し、半永久的にこの抗a抗体のみを産生するようにして、作製されます。従って、ポリクローナル抗体よりも他の類似抗原に対する交差反応性は極めて低くなり、より厳密にその抗原の存在を同定することが可能です。
もちろん、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のどちらでも、さらに厳密に抗原の存在を同定するためには、抗体をサンプルと反応させる前にその抗原と反応させて吸着させ、それをサンプルと反応させて全く陽性反応を示さないことを確認したり、標的抗原を前もって特異的なプロテアーゼで分解してから抗体を反応させて陰性となるのを確認することで、より結果の信頼性を高める作業は必要です。

簡単に言えば、モノクローナル抗体は単一のエピトープを認識する抗体しか存在しないため、交差反応性を低くし、より厳密にそのエピトープの存在を同定する目的で生産されるようになり、かつ半永久的に産生可能であるため、安定した供給が可能であることが最大の理由です。

抗原には多数の抗原決定基(エピトープ)が存在します。ポリクローナル抗体は、ある抗原のこれら複数のエピトープ(例えば抗原蛋白の数カ所のアミノ酸配列部分)を認識します。つまりこれはポリクローナル抗体が含まれる血清中には、その標的蛋白抗原の「a」というエピトープを認識する抗a抗体、「b」というエピトープを認識する抗b抗体、「c」というエピトープを認識する抗c抗体…、がブレンドされた状態で存在するためです。(生体内における免疫で、同様の現象が起こっています)
従って、このポリクローナル抗...続きを読む

Q蛋白の分子量(kDa)を調べる方法

かなり低レベルな質問なのですが、、、、
分からなくて困っています
約750個のアミノ酸からなる蛋白の分子量を知りたいのですが、どうやって調べたらいいのでしょうか?
よろしくお願いします

Aベストアンサー

アミノ酸配列データがあるなら、計算してくれるソフトウェアがあります。市販の遺伝子解析ソフトウェアには必ずついている機能ですが、ウェブ上でできるサイトもあります。たとえば

http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html

実験的に調べるなら、SDS-PAGE、ゲルカラムクロマトグラフィ、TOF-MASSなど、材料や精度に応じていろいろ方法があります。

Q抗原抗体反応について

ウエスタンブロット法による特異的たんぱく質の検出反応を先日行ったのですが、一次抗体、二次抗体をもちいて反応を行いました。

抗体抗原反応を行う上で免疫応答反応の理論を用いて検出しているのはわかりますが、なぜ二次抗体を使う必要があるのでしょうか?

自分の考えでは、一次抗体だけでは免疫応答反応をすることができるが、どこの特異的たんぱく質と反応しているかをより明確にするために二次抗体に発色するたんぱく質などをつけた上で反応を見やすくしているのではないかと考えているのですが…。

詳しく教えてくださるとありがたいです。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

一次抗体は特異的たんぱく質を抗原として認識し結合します。二次抗体は一次抗体の定常部位を抗原として認識し結合します。ポリクローナル抗体は一つの抗原たんぱく質の複数の場所に結合しますから、一次抗体と二次抗体を使うと、一次抗体の結合した場所に一次抗体よりも多くの二次抗体が結合することになります。つまり、二次抗体を使う方が特異的たんぱく質の検出感度を上げる事ができるということです。

二次抗体は酵素などで標識されていて、酵素反応によって抗体の結合した位置を知るわけですが、一次抗体に標識を行っても同じ事はできます。しかし、個々の一次抗体に標識を行うより、複数の一次抗体を認識できる二次抗体を大量生産し標識を行う方が、コストや収量などの点から見て優れています。上に書いた通り二次抗体を使う方が検出感度も上がりますから、この方法が広く使われているのです。

QSerine conformationって?

ある医学系の論文で出てきたのですが、ある種の蛋白の特定のアミノ酸配列に対して反応するmonoclonal抗体についての内容で、抗体作製時の抗原がウシ由来の蛋白で、それを用いてヒトの組織を免疫組織染色すると、その蛋白が正常のものではほとんど染色されることはなく、リン酸化等の修飾により変性が進み、構造が変化したものが陽性に染色されるとのことです。
その原因として、ある特定の位置のアミノ酸がウシではserineであるのに対し、ヒトではprolineであるため、正常の蛋白はいまいち反応しないものの、その変性した蛋白で陽性反応を示すのは、prolineが "serine conformation"を起こしているためと結論づけています。
このserine conformationとは、一体どのような状態なのでしょうか?

Aベストアンサー

MiJunです。
ryumuさん、お礼が遅くなりましたがありがとうございました。
実は、ご紹介頂いた本をryumuさんが投稿される前に図書館から借り出して来て読んである程度理解してからと思ってましたので(これ以外にも3冊程借り出してますが)。

ryumuさん、基本的な質問から
1.tau 2が認識するシークエンス(sonorinさんの補足より)
 (Bovine)  AGIGDTSNLEDQAAGHVTQARMVSK …tau-2免疫抗原
 (Human)  AGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSK
 この部分の二次構造を予測することは可能でしょうか?
⇒1-2サイトで「二次構造予測」するのを見つけて、入れてみましたが駄目でした。
 (データが蓄積されていないと・・・?)
2.先に紹介したBBRCのPaperのように、同じシークエンスのペプチドを合成して
  NMR・CD等で検討すれば分かるのでしょうか?
3.「reverse-turn structure」とは、ご紹介頂いた本の「ターン」のどのタイプ
  に相当するのでしょうか?
--------------------------------------------------
sonorinさん、
確かに、C末に関してはconformationも含めて情報が多いようですが、N末に関しては情報が少ないようですね?
「tau抗体」に関しても、検索した論文にいくつか紹介されてますが、N末に関するものは補足で説明された以外には見つかりませんでした?

初歩的な質問ですが、
4.tau proteinは核内にあるのですよね?それで、tau proteinが存在する場(環境)はどのような場なのでしょうか?
 (種々のイオンの存在はあるのでしょうか?)
 ⇒最終的にはtau proteinは親水的な場にあるのか、疎水的な場にあるのか?
 おそらく親水的な場にあるのでは想像しますが・・・?
(関連ありそうな?論文)
Biochemistry 2000 Aug 1;39(30):9039-46
Role of phosphorylation in the conformation of tau peptides implicated in Alzheimer's disease.
Daly NL, Hoffmann R, Otvos L Jr, Craik DJ.
Institute for Molecular Bioscience, Centre for Drug Design and Development, University of Queensland, Brisbane, 4072 QLD, Australia.
・Immunodominant peptides corresponding to tau(224-240) and a bisphosphorylated derivative in which a single Thr and a single Ser are phosphorylated at positions 231 and 235 respectively, and which are recognized by an Alzheimer's disease-specific monoclonal antibody, were the main focus of the study.
・The nonphosphorylated peptide adopts essentially a random coil conformation in aqueous solution, but becomes slightly more ordered into beta-type structure as the hydrophobicity of the solvent is increased by adding up to 50% trifluoroethanol (TFE).
・a small population of species containing a turn at residues 229-231 in the phosphorylated peptide
・the selection of a bioactive conformation from a disordered solution ensemble may be an important step (in either tubulin binding or in the formation of PHF) is supported by kinetic data on Pro isomerization.
・Thr231 phosphorylation affected the rate of prolyl isomerization and abolished tubulin binding.
・we find evidence for the existence of both trans and cis forms of tau peptides in solution but no difference in the equilibrium distribution of cis-trans isomers upon phosphorylation.
・Increasing hydrophobicity decreases the prevalence of cis forms and increases the major trans conformation of each of the prolines present in these molecules.
5. J.Neurochem.の論文でFig.6の結果の読み方を教えて下さい。特に、Aの方ですが?
 (実験方法が良く理解出来てませんが?)
6.検索した論文の中には以下のようなものがあります。
J Biol Chem 1994 Aug 26;269(34):21614-9
Analysis of microtubule-associated protein tau glycation in paired helical filaments.
Ledesma MD, Bonay P, Colaco C, Avila J.
Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Cientificas-Universidad Autonoma de Madrid, Spain.
・paired helical filaments (PHFs), the major components of which are modified forms of the microtubule-associated protein tau.
・phosphorylation is one of the modifications that result in the polymerization of tau into PHFs.
・hyperphosphorylation alone is insufficient to explain the formation of PHFs.
・glycation may be one of the modifications hampering the binding of tau to tubulin in Alzheimer's disease, thus facilitating tau aggregation into PHFs.
glycationに関しては専門家の間ではあまり問題視されていないのでしょうか?

さらに関連しそうな論文のAbst.抜粋を載せます(またまた混乱させるかもしれませんが・・・?)
(1)J Biol Chem 1997 Mar 28;272(13):8441-6
Conversion of serine to aspartate imitates phosphorylation-induced changes in the structure and function of microtubule-associated protein tau.
Leger J, Kempf M, Lee G, Brandt R.
Center for Neurologic Diseases, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts 02115, USA.
・A phosphorylation sites (positions 156 and 327), first to alanine to eliminate phosphorylation, and second to aspartate, to mimic phosphorylation.
・a serine to aspartate mutation at position 327 results in a conformational change similar to that caused by phosphorylation of this residue.
・an additional mutation at position 156 to aspartate drastically decreases the microtubule nucleation activity of tau but does not affect the activity of tau to promote microtubule growth.
(2) Mol Biol Cell 1997 Feb;8(2):353-65
Functional interactions between the proline-rich and repeat regions of tau enhance microtubule binding and assembly.
Goode BL, Denis PE, Panda D, Radeke MJ, Miller HP, Wilson L, Feinstein SC.
Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of California, Santa Barbara 93106, USA.
・a relatively well-characterized "repeat region" in the carboxyl terminus (containing either three or four imperfect 18-amino acid repeats separated by 13- or 14-amino acid long inter-repeats)
・a more centrally located, relatively poorly characterized proline-rich region.
・the microtubule binding activity of the proline-rich region to Lys215-Asn246 and identified a small sequence within this region, 215KKVAVVR221
・these capabilities are derived largely from Lys215/Lys216 and Arg221
・combining the proline-rich region sequences (Lys215-Asn246) with their adjacent repeat region sequences within a single peptide (Lys215-Lys272) enhances microtubule assembly by 10-fold
・intramolecular interactions between the proline-rich and repeat regions.
・a model in which efficient microtubule binding and assembly activities by tau require intramolecular interactions between its repeat and proline-rich regions.

以上です。
さらに調べを継続したいと思ってます。

MiJunです。
ryumuさん、お礼が遅くなりましたがありがとうございました。
実は、ご紹介頂いた本をryumuさんが投稿される前に図書館から借り出して来て読んである程度理解してからと思ってましたので(これ以外にも3冊程借り出してますが)。

ryumuさん、基本的な質問から
1.tau 2が認識するシークエンス(sonorinさんの補足より)
 (Bovine)  AGIGDTSNLEDQAAGHVTQARMVSK …tau-2免疫抗原
 (Human)  AGIGDTPSLEDEAAGHVTQARMVSK
 この部分の二次構造を予測することは可能でしょうか?
⇒1-2サイ...続きを読む

Qウェスタンブロット法での非特異バンド

ある分子量のタンパクをウェスタンブロットで検出したいのですが、目的位置のバンドは薄く、別の決まった位置に濃いバンドが出てしまいます。
毎回、サンプルバッファーと混ぜて95℃加熱処理し、Non-fat milkでのブロッキングなどは行っています。
原因は何でしょうか?解決法などありましたら教えてください。

Aベストアンサー

> タンパクの立体構造をほぐすためにも加熱処理は必須ですよね
これについては諸説あって・・・あまり大きな声では言えないのですが、
煮ない研究者さんも結構いらっしゃるという話は聞きます。
特に通常のSDS-PAGEの場合ならなおさらのこと・・・
まあ、毎回煮なければ再現性はとれるので大丈夫なんでしょうが、
その方々がおっしゃるには「サンプルバッファに入れた時点で変性する」
とのこと。これで問題が起きることはそんなにないそうです。
唯一問題が起こりうるのが、ジスルフィド結合がある場合。
メルカプトエタノールが失活したサンプルバッファを用いたり
煮なかったりすると、よくわからないことが起きやすいと。
まあこれはタンパク質大量発現の系での話なので、
臓器にそのまま適用できるかはわかりませんが・・・

そういえば、サンプルバッファのメルカプトエタノールはフレッシュですか?

Q抗体価って何ですか?

抗体価って何ですか?高一にも分かるぐらい簡単な説明お願いします。

Aベストアンサー

例をヒトとします。ヒトの体の中には沢山の種類の抗体があります。
その中で、あるウイルスに反応する抗体はその中の一部です。
では、沢山ある抗体のうちのどの位、そのウイルスに反応する抗体が存在しているのか?
それを示す目安の値(あくまで目安)が抗体価です。
この抗体価が高いと、そのウイルスに対する抗体が沢山あることになります。抗体価が低いとその逆です。

ヒトなどの体内にある抗体に限らず、ある抗体の集団のなかで、
あるモノにくっつくことができる抗体の量を示す目安の値です。

QDMEM培地について。

DMEM培地に含まれる

・グルコース
・L-グルタミン
・フェノールレッド
・HEPES

それぞれの効果というか意味を教えてください。

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

L-グルタミンについては、
http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8
「培地にL-glutaminの添加は必要ですか?どの程度のL-glutaminを添加したらよいですか?なぜ information sheetにL-glutaminの記載がないのですか?」
を見て頂けると良いと思います。
最終的にはどの培地にも添加されます。

参考URL:http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8

Q細胞培養がうまくいきません。

接着性の細胞を液体培地で培養していますが、コンタミして困っています。
培養液には、抗生物質、抗真菌剤を加え、実験で使う器具はUV照射して使用しています。
培養容器は、フラスコです。インキュベーター内では、キャップを緩めて細胞が呼吸できるようにしています。
インキュベーターの湿度を保つために滅菌蒸留水を入れ、SDSを加えています。
ここで、ふと疑問なんですが、インキュベーター内でキャップを緩めなくてはならない場合は、アルコール消毒してからインキュベーターに入れたらよいのでしょうか?しなくてもよいのでしょうか?
現在は、インキュベーター内にフラスコを入れる際に、70%エタノールを吹き付けて入れているんですが、これだと、カビが生えてしまいます。(フラスコの外側に)

Aベストアンサー

まず下でfujishiroさんがおっしゃっている通り、培養液がコンタミしていないかを調べてみるべきだと思われます。冷蔵庫に入れてあると菌が繁殖しづらく、確認しづらいので、一日、室温に置いておきます。翌日、ビンを振ってみて白いものがユラユラとしていたらコンタミってことになります。

僕は使用する器具・試薬はすべて乾熱滅菌・オートクレーブ・ろ過滅菌を行っています。そして、たとえエタノール消毒していたとしても「手が触ったところは菌が付いている」と思ってそれらを使用しています。
あと以外と気が付かないところが原因だったりします。例えば誰かがピペット操作のときにニップルまで培養液を吸い上げてしまったのに、それに気づかず放置。後の人がそれを使ってコンタミだらけ・・・なんてこともあると聞きます。

あと、インキュベートについてですが、基本的に外側を消毒しなくても中身は平気です。70%エタノールを吹きつけてカビが生えるということはインキュベーター内の環境がよくないのではないでしょうか?一度、チェックしてみて、必要があれば掃除・滅菌をした方がいいでしょう。他の実験者の方(操作に慣れている方)のディッシュにも同じことが起こっているのでしょうか?

ちなみに失礼ですがkumanokophooさんは培養を始めて間もなかったリするでしょうか?始めのうちは気をつけているつもりでも、どうしてもコンタミの洗礼を受けてしまいます。でもしばらくすると慣れてきて失敗しなくなりますよ。

まず下でfujishiroさんがおっしゃっている通り、培養液がコンタミしていないかを調べてみるべきだと思われます。冷蔵庫に入れてあると菌が繁殖しづらく、確認しづらいので、一日、室温に置いておきます。翌日、ビンを振ってみて白いものがユラユラとしていたらコンタミってことになります。

僕は使用する器具・試薬はすべて乾熱滅菌・オートクレーブ・ろ過滅菌を行っています。そして、たとえエタノール消毒していたとしても「手が触ったところは菌が付いている」と思ってそれらを使用しています。
あと以外と...続きを読む

Qブロッキングって必要なのでしょうか?

蛍光染色法で2次抗体の非特異性を抑えるために、2次抗体と同種の動物の血清でブロッキングしなさいとよく書いてあるのですが、例えば2次抗体がヒトの血清タンパクで吸収済みのものを使用するときに、ヒトのタンパク質を調べる上ではブロッキングしなくてもよいように思うのですが、どうなのでしょうか?
やはりバックグラウンドは高くなってしまうのでしょうか?

Aベストアンサー

抗体を吸収処理するのと、ブロッキングは狙っているところがちょっと違います。

たとえば抗マウスIgGの二次抗体を、ラビット血清タンパク質で吸収してあれば、ラビット由来の一次抗体に交差反応するのを防ぐことができます。一次抗体でマウス由来のものとラビット由来のものをつかって、別々の抗原を検出できるようになります。


組織標本にせよウェスタンブロットにせよ、抗体に限らず、いかなるタンパク質でも多かれ少なかれ吸着します。あらかじめ適当なタンパク質を吸着させることによって、抗体が非特異的に吸着されるのを押さえるのがブロッキングです(この点に関しては、BSA、カゼイン、ヘパリン、各種血清、どれでも狙いは一緒です)。

特に組織標本の場合、タンパク質のなかでも特に抗体が非特異的に吸着しやすい性質があるかもしれません(たとえば、プロテインA/Gとか補体のようなタンパク質が存在するかもしれません)。また、それぞれの種の抗体が、内在的にもっている交差反応性があるかもしれません。そのためには血清、とくに後者の理由から、同種の血清でブロッキングするのがよいとされています。

ただ、私の経験では、どうしても「同種の」血清でなければよくないというようなことはありませんでした。
また、非特異的吸着や交差反応は、抗体ごと、サンプルの種類ごとに違うので、ブロッキングの必要性もまちまちです。ものによっては、全くブロッキングなしでもきれいに染まるものもあります。

抗体を吸収処理するのと、ブロッキングは狙っているところがちょっと違います。

たとえば抗マウスIgGの二次抗体を、ラビット血清タンパク質で吸収してあれば、ラビット由来の一次抗体に交差反応するのを防ぐことができます。一次抗体でマウス由来のものとラビット由来のものをつかって、別々の抗原を検出できるようになります。


組織標本にせよウェスタンブロットにせよ、抗体に限らず、いかなるタンパク質でも多かれ少なかれ吸着します。あらかじめ適当なタンパク質を吸着させることによって、抗体が非特...続きを読む


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