プラスミドのTE(pH8)に対する溶解度は高いんですか?

エタ沈後、エタノールを除去するとプラスミドの沈殿が残りますが、
これをTEに溶かすことがあるんですが、どのようにして溶かしたら
いいんですか?
溶解度が高いんならほっとけばいいと思いますが。
エタ沈はWAKOのエタ沈メイトというキットを使っています。

また、大量のエタノールを入れて精製した場合、チューブの壁面に沈殿が付くと思いますが、沈殿後に加えるTEの液料が少ない場合は液に接しない壁面の沈殿はどうやって溶かせばいいですか?
ピペットで落とすしかないんでしょうか?

また、完全に溶解したかどうかはどうやったら確認できますか?
透明になっていれば溶解したということになるんでしょうが。
沈殿自体が見えにくいのでなかなか苦労しています。

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A 回答 (5件)

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。


また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真空乾燥させると、溶液中に回収できずチューブに残る放射活性が非常に高いことがわかります。室温で放置、または37度くらいで穏やかに温めて乾燥させるのがいいです。

2.Mg++が存在するとDNAが非常に溶けにくい塩を作って溶けにくくなります(逆にこれを利用してEtOH沈殿の回収率を高める方法もあります)。これは純水に溶かそうとするときには難儀ですが、TEに溶かすのであればキレートされるのでそれほど問題ではありません。

沈殿を少量の溶媒に溶かすときには、タッピング(チューブの底をはじく)で、溶媒が十分な範囲をなめるようにすると良いでしょう。チューブの性質にもよりますが、沈殿が付いているところは、水はじきが悪くて液が残ります。壁に付いた液が軽くはじいただけできれいに取れるようになったら、溶けていると溶けたと思っていいでしょう。
また、おおよそ10 kb以下の小さなプラスミドならVortexを使ってもかまいません。

この回答への補足

真空乾燥するようにいわれましたが、
やりすぎると溶けにくくなるようですね。
エタノール沈殿にやるんですが、ある程度は真空乾燥しないと
エタノールが残ってしまうんじゃないでしょうか。
残っていると問題がありそうですが。
ピペッティングで完全に取り除くことができればいいんですが、
37℃、室温ですぐに乾燥するものなんでしょうか。

補足日時:2006/07/08 21:51
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少し裏技をしょうかいしましょう。

70%エタチン後70%エタノールを除いてこんど100-95%エタノールを加え遠心してみてください。もういちどエタノールを除き風乾すると乾きやすいです。真空乾燥までする必要はなく、もしするとしたら37度の大腸菌のインキュベーターにでも掘り込んで10分くらいおいとけば大丈夫です。

この回答への補足

37℃に10分入れると乾燥させすぎてまずくないですか?

7エタチン後、上清を取り除いてエタノールで再度遠心するのってめんどくないですか?

乾燥させすぎて解けにくくなるなら
乾燥させない方がいいかもしれないですね。
ピペッティングで丁寧に除去して室温で3分くらい乾燥させたらいいかもしれないですね。

真空乾燥は今ではあまり使わないみたいですね。

補足日時:2006/07/16 16:29
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ピペットで上手に吸い出すか、ピペットチップをつけたアスピレータで吸い取れば、室温で30分、37℃で5~10分もやれば十分です。

チューブの底を指でつまんでしばらく体温で温めるだけでも良いくらいです。逆にそれくらいでアルコールが飛ぶくらいにきれいに上清を吸い取っておかなければ、塩などの不純物もたっぷり残っているわけで。

ちょっと湿っていてもアルコール分は十分に飛んでいますし、少々アルコール分が残っていたとしても、TEに溶かせば後の酵素反応に問題ないくらい希釈されます。

いまだに真空乾燥しているというのは、時代遅れと言って良いと思います(Molecular Cloningの前の版でもすでに、避けるべきと書いてあったような、、、)。

この回答への補足

シークエンス反応後の70%エタチン後、上清を取り除いて真空乾燥させています。真空乾燥後、シークエンス溶液Hi-Di formamideに溶解しています。

補足日時:2006/07/09 01:41
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非常にきれいなDNAは完全に風乾しても、すぐに解けてくれると思います。

しかし大抵はそこまできれいじゃなかったりするのでしばしばかわかしすぎることで解けなくなることがあるようです。沈澱がかろうじてでも見れるようであれば、解けない時は、溶かした時それがぼうじゅんしてきて、透明または半透明なゲル状のものができます。溶液にそのようなものが見えなければ解けていると考えていいでしょう。

エタちん後、70%EtOHであらい、遠心してから70%EtOHを除く時にピペットで完全にとり、すぐに溶かすのが理想的です。そこが幾らか平らな部分があるチューブだとそれがやりやすいです。

>大量のエタノールを入れて精製した場合、チューブの壁面に沈殿が付く

ということですが、これも純度などでいくらかちがってきます。エタノールを加えた後5分ぐらい放置すると、より大きいDNAの凝縮が望めますのでそこに落ちてくる可能性が高くなります。
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答えになっているかわかりませんが、



最後に沈殿したDNAのペレットの状態で、解けやすさが変わります。

エタノールを除いた状態で、ペレットは白いと思いますが、これを風乾すると、だんだん半透明になってきます。さらに乾かすと、また白くなります。
 半透明の状態が、一番解けやすいです。
 乾燥が足りなかったり、乾かしすぎたりすると、溶けにくくなります。
 例えば、100mlの大腸菌のカルチャーで、キアゲンのMAXIで調整したペレットなら5分から10分、15分くらいで、半透明になります。最初は、ずっと見ていてください。TE量は、0.2mlくらいで十分だと思います。濃度で、1から3マイクログラム/マイクロリットルになると思います。

その半透明なペレットにTEをかけて、すこしたってから、TEをかけながらチップで擦れば、溶けると思いますよ。完全に溶けたかどうかは、わかりませんが、目で見て変なものが見えなければ、現実的には問題にならないと思います。
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ベイスターズがTBSからモバゲーを運営しているDeNAに親会社が移ったわけですがチーム名が「横浜DeNAベイスターズ」というのがなんか頂けないなと思います。まだまだ「DeNAって何?」って思う方々がいると思いますしね。なぜ社名を「モバゲー」に改称し「横浜モバゲーベイスターズ」にしなかったのでしょうか?

Aベストアンサー

ナベツネが「社名をあわてて 『モバゲー』と名前を変えて、球団を持てばいいだろうと考えるのは絶対の間違い。 企業の売名という条項にバッチリぶつかるんだよ。」と発言したことで、これに同調する球団が出てきたためです。このままではオーナー会議で承認されず参入すらできなくなるからモバゲーにできなかったのです。

「条項」とは野球協約32条に基づく非公開の内規で、ナベツネがいうには「球団経営の努力をしないまま、 売名行為のためにその球団を買おうとする場合、加盟を許さないということ」「そういう小細工でやったらね、なんとかラーメンとか、なんとかあんパンとか いう名前で、なんでも登録できることになっちゃうんだよ、商品名で」といったそうで。売名というより商品宣伝といったとも言われていますが。

要は今年の6月に社名変更しても後付はダメよということで、とりあえず今年はDeNAでいくそうですが、DeNAは近い将来社名変更する可能性(早ければ最初に言ってた6月?)もあるので、仮に変更したらその次の年から球団名も、ということも考えているかもしれませんね。しかし社名を変更するには結構大変で、広告などお金も莫大にかかるのでやるかはまだわかりませんね、

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Qエタ沈とイソプロ沈の違いについて

DNAを濃縮する際にしばしばエタノール沈殿またはイソプロパノール沈殿を行いますが、DNAを沈殿させる時にこの2つにはどのような違いが有るのでしょうか。イソプロ沈の方がトータルの液量が少なくなる事以外に違いがよく分かりません。収量や純度など、何か使い分ける点があるのでしょうか。

Aベストアンサー

ズバリwoodcity さんの仰るとおり液量が少なくて済む!
バルクで大量にDNA を取りたい時とか、サンプル量が多い時とかはイソ沈の方がいいんじゃないでしょうか。
あと、サンプルがたくさんある時はいちいちエタを吸うのがかなり面倒です。というわけで私はイソ沈派でした。

そういえば先輩が「こっち(イソ)の方がキレイ」と言ってました。余計なものが沈殿しないという意味だと思いますが、エタ沈でも十分シークエンスなんかは読めますし、あまり差を感じたことはないですねぇ。

Q横浜ベイスターズ

横浜ベイスターズのグッズが販売されている、
「ザ・ベイスターズ」というお店があるそうですが
オンラインショップもありますか??
あるならアドレスを教えてください。

Aベストアンサー

ザ・ベイスターズのオンラインショップならここです。
http://www.baystars-shop.jp/index.html

参考までに、店舗も有り、横浜スタジアムでナイターがある日は
22時頃まで営業しているそうです。

参考URL:http://www.baystars-shop.jp/index.html

QDNAの濃縮(イソ沈、エタ沈)がうまくいきません

 エタノール固定した動物組織からフェノクロ法でDNAを抽出していますが、最後の濃縮の段階がどうしてもうまくいきません。
 塩(3M酢酸ナトリウムをDNA溶液の1/10量)、共沈剤(ブルーデキストラン)、イソプロまたはエタノールを加えて冷凍庫にいれるとチューブの底にドロンとした粘性の高い塊ができます。この塊はこれまでに凍結サンプルを使った場合も時々できることがありましたが、今回はすべてのサンプルで発生してしまったので非常に参っています。

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 これは一体なんでしょう?PCRがうまくいかないのとBDで色がつくところを見ると糖類と核酸がごちゃまぜになったものかなと思うのですが、この塊からDNAだけをサルベージすることはできないのでしょうか?

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ご回答をお待ちしております。
 

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Aベストアンサー

#1です。
どろどろとなっているのは高分子の多糖なのではないかと考えました。
ですので、ゾルあるいはゲル上になっているものを凍結させるのは
それらを結晶化?させる意味合いです。
DNAは比較的容易に水に溶解することがわかっていますので、
凍結融解を行うことは不純物のみを沈殿させることを期待しています。
ただ、糖類の場合は結構水に易溶であったりするので、この方法は
効果的でないかもしれません。

#2にもあるとおりキットがあるなら、そして予算が許すなら
そのほうが時間も短縮できていいと思いますが、キットの各段階が
どのような効果をもたらしているのかを考えながらやらないと、
結局いろいろな面で無駄になるかもしれません。

そういえばかつて酵素抽出を植物から行ったときに、同様の粘性物質で
困ったことがあります。最終的には解決しなかったのですが、
1)イオン交換樹脂あるいはキレート剤を入れる。これは金属イオン等の
分離を行い、粘性物質の形成阻害を期待しました。
2)pHをかえる。
を行ったことがあります。酵素では一般的に、
そういうことがされているみたいですが
効果がありそうであれば、試してみてください。

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Q横浜ベイスターズを強くする方法

横浜ベイスターズを強くする方法

セリーグのみならず日本プロ野球のお荷物になりかけている
横浜ベイスターズ。今後この球団を優勝させるかせめて
クライマックスシリーズ出場くらいまで勝たせるには
どうしたらよいでしょう

Aベストアンサー

大魔神のいた頃は強かったんですがねぇ。。

私の住んでいる地方は、大魔神、斎藤(隆)、新沼等々ベィスターズで活躍している(活躍した)選手が多くいるので親しみがあります。


チーム力の基本はやっぱり守備からで、まずは投手陣の整備。いろいろと補強などもしているのですが、どうもベィスターズでそのまま活躍する選手は少ないですね。
挙げ句の果てには監督さんも「補強?」したのですが、今のところ成果は見えていません。

また、他の球団と比べて「生抜き」で成長株といった選手も少ないように感じますので、どうもこのあたりに問題があるのでと思います。

つまり、選手を獲得するまでは「同じレベル」でもその後の育成や起用法が上手くいっていないのではないでしょうか。

プロへ入るくらいの選手ですので、入団するまでの技術力などは他の球団と比べて大差はあるはずがありません。

そこからの問題で、技術育成などは人それぞれなので知る由もありませんが、どうも「闘う気持ち」「がんばれば一軍で活躍できる」といった雰囲気づくり、それらが感じられないのが選手個々の「向上心」を引き出せていないのではないでしょうか。

私の地方のプロ野球チームからすれば歴史があって優勝経験もあるベィスターズはとても羨ましく思います。強かったあの頃の「昔話」が出来るのは何事にも変えられない財産です。

あとは現在・未来のチーム作りを応援してみては如何でしょうか。

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QRNA抽出時のイソプロ沈やエタ沈で...

動物由来培養細胞でのRNA抽出をTRIzolで行っています.その過程でイソプロ沈,エタ沈がありますが,普段は白いペレットで見えるtotal RNAが,時折,ドロ~っとした半透明の油滴のように見える場合があり,なぜそうなるのかよく分かりません.
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分かりやすく教えていただけたらと思います.よろしくお願いいたします.

Aベストアンサー

一番可能性のありそうなのは、多糖類、とくにglycogenの共沈だと思います。
ヤマトのりのような半透明でジェリー状の沈殿を生じます。
Trizolでの精製過程で、多糖類はRNAの挙動はほとんど一緒なので同じくらい高い効率で抽出されてきます。その時々でそうなったりならなかったりというのは想像するしかないですが、細胞の生理状態、培地等からの持ち込み、系のキャパシティー不足などがあるのでしょうか。

glycogenのコンタミが多いと、
・溶けにくい、溶けない。
・粘性のためカラムを通りにくい、精製度が低くなる。
など、影響がある場合があります。用途にもよるでしょうけれど。

沈殿から多糖類を除く方法として、2 M LiCl水溶液に再懸濁(場合によっては沈殿をホモゲナイズして)して差次沈殿する(large RNAは沈殿し、多糖類は可溶)方法があります。

Qベイスターズから出た選手と来た選手…

こんちには

ベイスターズから他球団に移籍した選手は活躍してるとおもいませんか?
内川 相川 多村 村田 小池…

逆にベイスターズに移籍してきた選手はみんな活躍してないと思いませんか?
森本 中村紀 渡辺直 菊地 林 藤井 鶴岡 ラミレス…

↑の選手は みな前所属球団ではそれなりに活躍していたのに…
やっぱりベイスターズに原因が?

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こんばんは。

ベイスターズに来た選手の大半がもう終わっている選手です。
攻守のバランスが取れていないのでしょう。

Qアルコール沈殿(エタ沈)について

質問させてください。
いまDNAの勉強中なのですが、
DNA溶液にアルコールを加えると沈殿するのはなぜですか?
いろいろ調べても、その理由まで書いてあるものがないので
どうか回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

最近書き込んだものがありますので、ご参考になれば。

http://oshiete1.goo.ne.jp/qa2973525.html

Qベイスターズ

来月Wデートで横浜ベイスターズの試合を観に行くことになったのですが、野球のルールはなんとなく分かるくらいの知恵しかありません!相手側はベイスターズの大ファンらしいのでなんとかここだけは押さえておいたほうが良いということを教えて頂きたいです!
メンバーのことからチームのことまで…色々知りたいと思っています!

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どちらも早稲田大卒で細山田は斎藤祐樹の球を受けてきた頭脳派捕手で松本は俊足好守で1番を打てる逸材です。

あとはWBCで活躍の内川と村田と最近不調の吉村のクリーンナップに期待ですね。

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参考URL:http://dominoweb.dojindo.co.jp/goodsr5.nsf/View_Display/E005?OpenDocument


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