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PCRで増幅後、確認のためプラスミド精製、エタノール沈殿をしてから、TEに溶解後のサンプルを10μl泳動しました。
泳動後の結果を見てみると、とても発光が薄いバンドが見られました。(バンドが出た位置は大丈夫でした)いつもははっきり見えていたのにと思い、もう一度やってみましたが、結果は同じでした。私の研究室ではEtBrを先に入れてゲルを作っています。なにがいけないのかがわかりません。一緒に入れたDNAマーカーも薄いです。この発光の濃淡はDNA濃度とも関係してくるのでしょうか?わかりにくい質問ですみません。よろしくお願いします。
No.2ベストアンサー
- 回答日時:
先染めで薄かったら、そのまま後染めをして見ましょう。
ゲルにいれたEtBr濃度が低かったからとか、EtBrが溶出しているとか(EtBrはDNAと逆向きに流れるので、低分子DNAのほうからEtBrが抜けてしまいます)いった場合にはこれで解決です。
通常、UV照射装置は感度が最高の短波長と、DNAへのダメージが少なく切り出しに適した長波長の切り替えがついています。長波長に切り替わっているとバンドの蛍光強度は低くなります。そうなっていないでしょうか。
>この発光の濃淡はDNA濃度とも関係してくるのでしょうか?わかりにくい質問ですみません。よろしくお願いします。
EtBrの染色強度でDNAの定量をするくらいですから、DNA量(重量)と蛍光強度には正の相関があります。いつも使っているマーカーも薄いとなると別の原因でしょうけれど。
No.3
- 回答日時:
ゲルはいつも作りだめしていらっしゃいますか?
作製して日がたったエチブロ入りゲルの場合、質問者様がおっしゃっているような現象(マーカーまでも発光が薄くなる)が経験上よくあります。
私はゲルを作り直してもう一回泳動しなおします。
ありがとうございます。確かにうちの研究室では作りだめをしてますね。後輩に聞いたところ新しいのを作ってくれるとのことでした。なので作るように頼んでおきました(笑)(私は作る暇がないといったので)
No.1
- 回答日時:
サンプルはどうなのかわかりませんが・・・。
今までと同量のDNAマーカーを使用し染まりが薄いなら、エチブロの問題です(薄いのでは?)。
作り直しorエチブロ足しましょう。
あと周りの人にも聞いてみて。
・同じマーカー使った人→はっきりバンドが出たか
・最近エチブロ使った人→染まり具合はどうだったか
何で紫外線照射してるかわかりませんが、その機器は大丈夫ですか?使用法あってますか?今までと同じ設定ですか?
確認してください。
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