Hisタグを用いたタンパク精製

もし、分かる方がおりましたらアドバイスよろしくお願いいたします。
私は、枯草菌の研究をしています。
ある遺伝子の働きが「ラセマーゼ」ではないかということをin vivoの実験において確認しました。
しかし、in vivoにおいては十分に証明できなかったのでin vitroでタンパクを精製し、ラセマーゼ活性を測定しようと考えています。
pET15bにこの遺伝子を組み込みHisタグを付けてニッケルカラムで抽出しようとしているのですがうまくいきません。
何かわかることがありましたらアドバイスよろしくお願いいたします。

No.2 ベストアンサー 回答者： takes87 回答日時： 2006/10/18 20:50

　Hisタグを用いたたんぱく精製はやったことはないのですが、職場の同僚がいろいろ悪戦苦闘していたのでそこで出てきた問題点が参考になればと思います。

　増殖しない：菌株をいろいろ試すことで解決
　不溶化する、ニッケルカラムを素通り：Hisタグを導入する位置を変えたり、あいだにさらにペプチド鎖を入れる。

　ニッケルカラムの素通りはHisタグが内部に折り畳まれている可能性があるとのことでした。

　ちょっと専門外なので外れているところがあるかもしれません。
　

この回答へのお礼

私自身、遺伝子をメンイにやっていたためタンパクの知識はあまりありません。
とても参考になりました。
こちらの意見を参考にいろいろ調べてみます。
ありがとうございました。

お礼日時：2006/10/20 00:46

No.1 回答者： Dr_Hyper 回答日時： 2006/10/18 10:36

どこまでうまくいっていて、何がうまくいかないのでしょうか。

plasmidはちゃんとできていますか？
His-ラセマーゼタンパク質は発現していますか？
ニッケルカラムはちゃんと水色をしていますか？
その他還元剤やEDTAを多量に使用しているとか、カラムにとってやってはいけないことをしていませんか。
考えだすときりがないので、この辺で。

この回答へのお礼

ご丁寧にありがとうございます。
上述したのは、前任者が実験を行った結果うまくいかなかったことを記述してみました。
私は、これからこの実験を始めることになりました。
構築したプラスミドがありましたが、確認はまだしておりません。
今回、目的としている遺伝子はオペロンを構成しており、そのうちのひとつの遺伝子にHisタグをつけたものはきちんと精製できましたが、今回目的としている遺伝子においては精製できなかったみたいです。
ニッケルカラムは、水色というか白色をしております。
遺伝子を主にやっていたので、タンパク精製の知識はほとんどありません。
なのでこれから論文などを素にいろいろ調べてみようと思います。
プロトコールどうりにおこなっているので、カラムにとってやっていはいけないことはしていないと思います。

お礼日時：2006/10/20 00:53