Native-PAGEをウェスタンに使う

色々な論文でNative-PAGEをウェスタンに使っています。私も２つのタンパクの相互作用を見るためにアクリルアミドの％を振って試してみましたが、どうもタンパクがうまくながれません。ちなみに見たいタンパクは１００KDです。
この手法を試された方、一般的な注意点などありましたら、アドバイスいただけますか。
よろしくお願いします。

No.1 ベストアンサー 回答者： geneticist12 回答日時： 2006/12/17 20:53

SDS-PAGEでは、分子量に比例してタンパク質に負電荷を持つSDSがくっつき、すべてのタンパク質の電荷は負になます。

また、変性条件なので高次構造をとらないので、ペプチド長と移動度が相関するようになります。

Nativeでは電荷はタンパク質の等電点によって変わり、立体構造のため分子量と移動度が必ずしも相関しなくなります。等電点が高いタンパク質は逆向きに移動するということもあります。

お使いの泳動条件は、目的のタンパク質のbinding条件と泳動して分離できる条件を両立しているでしょうか。

最近流行の方法でblue-native PAGE（BN-PAGE）というのがあります。
これはSDSのかわりにCoomassie blueをくっつけることで、Nativeに近い状態（タンパク質のbindingも保持することが可能）で、すべてのタンパク質の電荷を負にして、SDS-PGEと同様に分離する方法です。
参考まで。

この回答への補足

ご返答ありがとうございます。
blue-native PAGE（BN-PAGE）というのがあるのですね。早速見てみようと思います。ありがとうございます。

補足日時：2006/12/18 08:48

No.4 回答者： caliente 回答日時： 2006/12/19 10:19

どちらも発現量が少ないのなら、とりあえずウエスタンで見るのが早そうですね。

サンプルバッファーのpHがずれてなくて、なおかつ塩濃度が濃すぎてバンドが乱れている様子が無ければ、pHの異なるバッファー系(とりあえずは酸性バッファー系かな？)でNative-Page、転写を行なってみるのは如何でしょう？
Davis系と違ってバンドはシャープに出にくいですが、pHの異なるバッファー系を用いたNative-Pageは、『蛋白質・酵素の基礎実験法　改訂版』(南江堂、1994)辺り(古いですが...)を参照されてみては如何でしょうか？

ただし、No.1さんが指摘されている様に、泳動分離条件と相互作用の条件(もちろんターゲット蛋白の安定性も)が一致させる事は重要ですね。
でも、まずはそれぞれが泳動される状態を確認するのが先決ですね。

ps. 多分関係ないですが、ターゲット蛋白が100kDaぐらいあるのなら、培養上清を割とカットオフが大きい(50kDaぐらい)限外ろ過膜を使用して濃縮すると、低分子側の夾雑蛋白質もすっきり抜けて条件がより良くなるかも知れません。というか、濃縮時にターゲットをロスっていませんか？

この回答へのお礼

ありがとうございます。
皆さんの回答で、これから検討していく課題が見えてきました。

お礼日時：2006/12/20 16:22

No.3 回答者： caliente 回答日時： 2006/12/18 22:46

実験系がわからないのと、どの段階が問題になっているか質問文からはイマイチ掴めませんが、文脈から行くと最初のNative-PAGEの段階で既に上手く泳動出来ていないと言う理解で宜しいでしょうか？No.2さんへの補足を見てると、途中確認せずに最後まで全部やってしまって、ゲル濃度は変えてやってみたものの、何が何か訳解んない状態とか...(すいません)。

> アクリルアミドの％を振って試してみましたが、どうもタンパクがうまくながれません。ちなみに見たいタンパクは１００KDです。

何パーセントぐらいのゲルか解りませんが100kDa程度なら10%でも問題無いでしょう。というか、ゲルの濃度を変えても泳動度が変化しない(それも確認していないですか？)なら、No.1さんの言うように、ターゲットの等電点が塩基性で、十分に泳動出来ていないか、あるいは逆方向に泳動されている可能性がありますね。逆方向に泳動されているなら、PVDF膜に転写するときも、電流を流す向きを逆にしてあげる必要がありますし、(Tris-Glycineなら)ターゲットの等電点が7.5ぐらいを越えてくると転写効率を上げるには、条件に若干の工夫が必要があります。

２つの蛋白の相互作用を見たいと言う事ですが、それぞれ一つずつ泳動して(普通のNative-PAGEだけ)、まず最初の泳動が出来ているか？その振る舞いを確認するのは如何でしょう？もしかして、No.2さんへの補足を見ていると、どちらも精製されていない培養上清かな？まあそれならウエスタンで見るしかないですが...。ご経験が少なそうにお見受けしましたので、とりあえずどちらかドカンと量のある方のターゲット蛋白だけでも泳動・転写が上手く出来ている事を確認されては如何でしょうか？そして、まずは最初の泳動条件(結局転写条件にもつながる)を決定するのが、先決ではないでしょうか？（ジジ臭いですが...。）
それとも、どっちらのターゲットも何処にバンドがあるか解らないぐらいしか発現していない様な培養上清ですか？？

この回答への補足

ご返答ありがとうございます。

使ったのは２つのタンパク両方について、SDS-PAGEでは確認できないほどの培養上清を濃縮したものでした。それぞれのタンパクを１つずつ発現したもの、および両方を一度に発現させたもの、それぞれについてNative-PAGEを行い、ウェスタンを試みました。
Nativeでウェスタンを行うのは初めてだったもので、条件検討を十分していません。みなさんのおっしゃるとおり、考慮する点を一つづつ、つめて行こうと思います。ありがとうございます。

補足日時：2006/12/19 09:39

No.2 回答者： Dr_Hyper 回答日時： 2006/12/18 00:36

Native-PAGEはもちろんwesternで使われていますが、結構難しいですよ。

タンパクによっては逆にトランスファーされますし、効率も非常にわるいです。で、transferから先に書いてしまいましたが、泳動の問題だと思われているのですね。それはマーカーなどは流れているけど、目的のタンパクが流れないということですか？
アクリルアミドの濃度も大事ですが、電圧の掛けかたやサンプルの塩濃度などもかなり効いてきますので、最初はCBBなど全タンパク質の染色からトライされた方がいいと思いますが、もうそれはクリアされてますでしょうか？

この回答への補足

ご返答ありがとうございます。
マーカーはサイズを見るためというより、流れを見る参考までに入れていましたが、マーカーは流れますが、タンパクは上の方に滞っているようです。
電圧の掛けかたやサンプルの塩濃度なども見てみなければならないのですね。電圧は弱めで時間をかけた方が滞りにくいのでしょうか。
それからご質問のCBB染色についてですが、単なる培養上清を使っているため、あえて染色してみませんでした。

補足日時：2006/12/18 08:42