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実験で色素をクロマトグラフィーで分離した後、分離したクロロフィルaの蛍光スペクトルを測定したのですが、660nm辺りのピークの吸光度が0.2(濃度低)になるものを分光蛍光光度計で測定したところ励起スペクトルのピーク付近では異常はなかったのですが、660nm辺りの吸光度が1.8(濃度高)になるものを測定したところ励起スペクトルのピーク付近で放物線がくぼんでしまう(0.2では662nmがピーク波長として検出されたものが1.8の方は662nmがバレー波長として検出され、その前後の655nm,671nmがピーク波長として検出されました)異変が生じました。この異変はなぜ起きるのでしょうか?よろしくお願いします。

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A 回答 (1件)

クロロフィル蛍光と蛍光の再吸収に関する質問と推察します。



ただし,私の読解力が足らないせいかもしれませんが,
吸光スペクトルと励起スペクトルと蛍光スペクトル混同してしまいます。

吸光スペクトルのピークが660nm付近にあるサンプルを用いたのはわかりますが,ある励起波長で励起された蛍光スペクトルのピークについて言っているという解釈でよろしいでしょうか。

そうであれば,励起されたクロロフィルからの蛍光が,周囲のクロロフィルによって再吸収されたことが原因だと思います。クロロフィルの蛍光ピークは吸光のピークと近しい値にあるため(もちろん蛍光の方が長波長ですが),高濃度サンプルの場合,励起光→吸収→蛍光→再吸収→蛍光→再吸収…の連鎖が起こります。再吸収のされやすさは吸光スペクトルの通りです。

ところで,クロロフィル蛍光は一般に,蛍光ピークを二つ持ちます(685nm付近と730nm付近)。730nm付近の蛍光は再吸収の影響を受けないので,二つのピークを両試験区で比較されると解析のヒントになると思います。

ただし,z0z0z0z0zxさんのおっしゃるような現象は私は見たことがありません。現象を批判的に解釈すれば,以下の検討の余地があるかもしれません。

励起光と検出器の光路が直角となる蛍光光度計では,吸光度の高すぎるサンプルは計測に適しません。励起光がサンプル表面までしか達さないため,検出される蛍光がサンプルの元の蛍光状態を反映していない危険性があるためです。推奨濃度については,マニュアルを良く読まれたらよいかと思います。
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この回答へのお礼

大変参考になりました。ありがとうございます。

お礼日時:2007/07/11 02:38

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Q蛍光スペクトル

蛍光スペクトルと励起スペクトルについて教えてください

励起光の波長を変化させて蛍光の波長を固定して測定したものが励起スペクトルで、励起光を固定して蛍光の波長を測定したものが蛍光スペクトルだというのはわかるのですが、2つがどういうものかということがよくわかりません。

教科書のスペクトルと見ると、横軸は波数で蛍光の波長だと、わかるのですが、励起光の波長はどこに表されているのでしょうか?

またどうして励起スペクトルと蛍光スペクトルが鏡像関係にあるのかもわかりません。

あまり難しい言葉や数式は使わずわかりやすく回答してもらえれば幸いです。

Aベストアンサー

#1さんの説明の通りですが、いくらか、図などがあった方がわかりやすいかもしれませんので、参考URLにgoogleで出て来たページを紹介します。ページ中程にあるJablonski Diagramの左側が蛍光について示した物です。以下、おそらく溶液の蛍光についての質問であると予想して、述べます。

さて、蛍光の過程について述べますと、蛍光とは図にある青の矢印に対応する励起光を分子が吸収します。その後、図では黒色の矢印で示された光を発しない緩和過程(溶媒などに熱エネルギー等の形でエネルギーを渡し、エネルギーの低い状態へ移動する)を経て励起状態振動基底状態へ移動します。そして、図では緑の矢印で示されている蛍光が発光します。

質問者様のおっしゃる励起スペクトルはこの青色の矢印の波長を変えながら緑色の矢印すべてひっくるめた蛍光全体の強度を測ります。このとき、電子励起状態の振動基底状態や振動励起状態(図では太い横線が各電子状態の振動基底状態を示し、その上の細い横線がその電子状態の振動励起状態を示しています。)へ励起されますので、励起光の波長は電子励起状態の各振動状態のエネルギーに対応したものとなります。溶液などでは、振動励起状態へ励起してもすぐにその電子状態の振動基底状態へ緩和されますので、緑の矢印全体の強度というのは、励起された分子の数に比例します。つまり、励起スペクトルは分子の吸収スペクトルに比例したようなスペクトルが得られるわけです。(もちろん、いろいろ例外はありますが)

さて一方、質問者様のおっしゃる蛍光スペクトルは緑色の矢印をさらに分光器などで分散させて矢印一本一本を別々の波長として観測するスペクトルです。つまり、波長は電子励起状態の振動基底状態から電子基底状態の振動励起状態のエネルギーに対応したものとなります。

蛍光スペクトルにおいて、励起光の波長がわからないと言うことですが、溶液などでは励起分子はすぐに電子励起振動基底状態へ緩和しますので、励起光の波長を変えて励起する分子の振動状態を変えても、蛍光スペクトルはすべて電子励起振動基底状態からのもので、波長とその強度比は変わりません(励起スペクトルのように全体の強度はかわりますが)。このような場合、励起光の波長を書かないことが多いです。

図でもわかるように、励起光の波長と蛍光発光の波長はは電子励起振動基底状態のエネルギーをはさんで、励起光は電子励起状態の振動エネルギーだけ高いエネルギー(短い波長)になり蛍光は電子基底状態の振動エネルギーだけ引いエネルギー(長い波長)になり、それぞれの振動エネルギー構造が似ていれば、鏡像のような形になることがわかります。

以上、「励起光が書いていない」ということから類推して、すべて溶液の蛍光測定と仮定してお答えしました。気体や分子線を使ったLIFではちょっと話がかわってきますので、その点はご留意ください。

参考URL:http://www.jp.jobinyvon.horiba.com/product_j/spex/principle/index.htm#01

#1さんの説明の通りですが、いくらか、図などがあった方がわかりやすいかもしれませんので、参考URLにgoogleで出て来たページを紹介します。ページ中程にあるJablonski Diagramの左側が蛍光について示した物です。以下、おそらく溶液の蛍光についての質問であると予想して、述べます。

さて、蛍光の過程について述べますと、蛍光とは図にある青の矢印に対応する励起光を分子が吸収します。その後、図では黒色の矢印で示された光を発しない緩和過程(溶媒などに熱エネルギー等の形でエネルギーを渡し、エネルギ...続きを読む


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