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なぜDNAは波長260nmで高い吸光度を得られるのでしょうか??
ぜひ教えてください!!m(__)m

A 回答 (1件)

特異的な吸光度は、わかりやすく極端に言えば、π軌道を2つ以上持つ分子で得られます。


つまり二重結合がいくつかあるような場合に特異的な吸収スペクトルが見られるわけです。

DNAを形成する塩基部分のATGCは、プリン骨格とピリミジン骨格を持ちます。これらは、特異的な吸収スペクトルを示します。

4つの核酸塩基は、それぞれ吸収スペクトルの最大波長(λmax)も吸光係数(εmax)が異なります。
それぞれの塩基のλmaxは、Aが259nm、Cが267nm、Gが253nm、Tが267nmです。
平均して260nmなのです。
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この回答へのお礼

そうだったんですか!分かりました!!ありがとうございました!!

お礼日時:2007/05/19 15:04

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Q吸光度とDNAの純度

260nmの吸光度/280nmの吸光度の比で、なぜDNAの純度が分かるのですか?
誰か教えてください。

Aベストアンサー

核酸やタンパク質に含まれている発色団の吸収極大波長を以下に示します。

核酸に含まれる発色団
 グアニン:248 nm
 アデニン:263 nm
 チミン:264 nm
 シトシン:274 nm

タンパク質に含まれる発色団
 フェニルアラニン:257 nm
 チロシン:275 nm
 トリプトファン:278 nm

大雑把に見て、核酸系の方が低波長にピークを持っていますね。ですから、低波長の吸収が核酸の濃度を示し、高波長の吸収がタンパク質の濃度を示す、ということが大雑把に分かります。

もしタンパク質にフェニルアラニン、チロシン、トリプトファンなどが含まれていなければ、核酸とタンパク質との混合比などを議論することはできません。

QDNA,RNAの吸光度(濃度)測定について

よく核酸の濃度測定をするのですが,測定の際いつも240nm~320nmの吸光度のグラフを確認しています.

そこでお聞きしたいのですが,
(1)普段は260nmで核酸の吸光度がピークに達し,きれいな山型が描かれますが,時折,240nmの値が高めで右肩下がりのグラフになってしまうことがあります.280nmの吸光度が高いのは蛋白が混入しているものと認識しているのですが,260nm以下の領域が高くなる時はどういったことが考えられるのでしょうか.

(2)それともう一点,吸光度の比『A260/A280値』で,純度が高ければDNAは1.8,RNAは2.0で,当然蛋白が混入すれば比は1.8未満になるのは理解できるのですが,特にRNA濃度の測定の際,比が2.2近くになる事があり,それがどういう意味を持っているのか知りたいと思っています.

どちらか一方でも構いませんので,ご存知の方がおりましたら分かりやすく教えていただきたいと思っています.よろしくお願いいたします.

Aベストアンサー

#2です。参考文献を挙げておきます。

参考URL:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=9067025

Q吸光度計を用いたDNAの純度

 吸光度計を用いたDNAの純度は、A260/A280が1.8~2.0で高純度となり、<1.8だとタンパクなどの不純物の存在が考えられると色々な文献で目にします。
 それでは、>2.0の場合はどのように考えればよろしいのでしょうか?

 260nmは核酸の測定波長で、280nmはタンパクの測定波長だということはわかります。>2.0ということは、核酸の値がタンパクの値より高いということになりますが、これは高純度と評価しても良いのでしょうか?1.8~2.0という範囲なので、高すぎても高純度とは言えない理由があるのではないかと思いますがわかりません。

 ちなみに測定値は
・260nm:0.061
・280nm:0.027
でA260/A280は約2.2となりました。

回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

 純粋な物質には、特定の吸収スペクトルがあります。タンパクは280nm、核酸は260nmに極大吸収があり、その波長がよく利用されています。核酸やタンパクに限らず、純粋な物質は、波長の比は一定の値をとります。
 核酸では、260nm/280nmの吸光度の比だけでなく、260/240,260/250,260/270,260/280,・・・・と、純粋であれば、どの波長の吸光度比も一定の値をとります。

 したがって、純粋なDNAの260/280の吸光度比が1.8であれば、「純粋」であることは否定できませんが、保障するものではありません。
 むしろ、1.8であるハズのものが2.0ならば、純粋でない⇒不純物が混在する、と判断できます。

QBSAとゼラチンの違い

昨日、生物の実験でたんぱく質の検出をしました。
実験をして思ったのですが、BSA溶液とゼラチンをそれぞれ同じ量で実験をしたのになぜ吸光度が違うのですか?
また、ビウレット反応のときの発色も違いました。

構造の違いなのでしょうか?詳しく教えてください!!

Aベストアンサー

おそらく中高生か化学やバイオ系ではない学生と察してお答え致します。

BSAとゼラチンはどちらもタンパク質ですが、タンパク質の種類・構造が異なるので結果も異なります。
BSAは仔牛血清アルブミンというタンパク質、ゼラチンの主成分はコラーゲンです。

分光光度計では、おそらく280nmの吸光度のピークを見たと思いますが、これはタンパク質全体ではなく、中の芳香族アミノ酸(L-チロシンとトリプトファン)由来の吸光度です。
アルブミンとコラーゲンでは、チロシンやトリプトファンの割合が異なるということです。

ビウレット反応は、1コのNを隔てて存在する2コのアミド基(ペプチド結合部分;-CO-NH-)がCu2+に配位した部分にビウレットが結合して染色されます。
アルブミンとコラーゲンが同じ質量でも、同じアミノ酸種と数でできているわけではなく、アミド基の数が異なるということです。

こういった化学は、全般に化学反応式やイラストを描いて考えると理解しやすいですよ。

QDNAの定量方法

質問させてください。
肝臓からDNAを抽出する実験を行い、
白い糸状のDNAを得たのですが、
そのDNAを定量するにはどうしたらよいのでしょうか?

いろいろなものを調べて、吸光度というのを利用するのかな?
と思ったのですが、その意味も分からないし、方法もよく理解できません。

どうか、教えていただけませんでしょうか?
よろしくお願いします!

Aベストアンサー

ゲノムDNAの定量の場合、ぱっと思い出せるのは、(1)分光光度計(吸光度を持つ共雑物がなければ定量性高)、(2)ゲル電気泳動(見たい分子量がゲノムDNAだと思いますのでアガロースがよいでしょう、定量性低)、(3)定量PCR法(リアルタイム-PCR)、(4)Invitrigen社のPicoGreenアッセイキット、(5)アジレントバイオアナラーザー2000といったところでしょうか。目的に応じて異なります。簡単で汎用性が高いのはダントツで分光光度計です。

QBSAとチロシンの最大吸収波長の関係・NADPHの構造について

実験のレポートに必要な情報なんですが、調べるのに苦労しています。明日、レポート提出なので、知っている方は教えてください。

1.BSAの最大吸収波長とチロシンの最大吸収波長が近い理由。
2.NADPHのどのような構造が最大吸収波長を二つ生み出すのか。

一応、予想はついていますし、私も自力で調べていますが、より確実なものにしたいので、ご協力お願いします。詳しいことが分からなくても、参考になるホームページの紹介や良い検索方法などを教えていただけるだけでも大助かりです。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

この手の強い紫外線吸収は、大抵芳香環のπ電子に由来するものです。

チロシンの吸収はベンゼン環に由来するもので、
NADPの場合は、ニコチン基のピリジン環とアデニン基のプリン環に
由来するものです。

酸化型のNADPの場合、ピリジン環とプリン環がほぼ同じ位置に吸収を
示すのに対して、NADPが還元されるとピリジン環の構造が変わるため、
二種類の吸収が出ることになります。

BSAの最大吸収波長が、チロシンと近いのは、
takakokoreoさんがおっしゃる通り
ポリペプチド鎖にチロシンをある程度含んでいるからですね。
タンパク質に遷移金属が含まれていたりすると、
「最大」吸収波長の座を奪われたりします。

QDNAの加水分解について

DNAを塩酸とともに湯浴で加熱して加水分解をする実験について疑問があるので質問させてください。

この方法で加水分解して、塩基・糖・リン酸の単位まで細かく分解できますか?
また、できる場合、どのくらいの時間加熱すれば完全に分解できますか?

Aベストアンサー

塩酸を添加して過熱するとDNAのプリン体のみが選択的に加水分解します。URLを参照してください。

参考URL:http://www.jichi.ac.jp/usr/path/stain/feulgen.html

QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

Q抽出DNAの保存

PCRに使用するため臓器から抽出したDNAを4℃で保存中ですが、保存期間はどのくらいまでが限界でしょうか?また、-20℃では保存期間はどのくらいですか?

Aベストアンサー

精製度によると思います。
簡易な方法で粗精製したものだと数週間から数ヶ月で明らかな分解が認められることがありますが(それでもPCRには使えるかもしれませんが)、超遠心法、フェノール抽出を慎重に行う、イオン交換カラムで精製などでnucleaseのコンタミを排除しておけば、数年単位の長期間にわたり4℃で分解なく保存できます。
私は最近、3年以上前にQiagenのDNaesyで精製してそのまま4℃で保存したゲノムDNAを使いましたが、電気泳動像に分解は認められずPCRの増幅も良好でした。

長期保存する場合、注意する点は、溶媒をTEにしておくこと(純水だとpHが酸性に偏るなどが原因で分解が起きやすくなる)、DNA濃度をあまり低くしないことです(たとえば数十ng/uL以上にする、水分子によるアタックを抑えるため)。

-20℃、-80℃などで凍結保存すれば、粗精製のDNAでも半永久的に保存できます。ただし凍結融解で物理的にせん断されてくるので、バックアップとして長期保存する場合はともかく、日常使うサンプルとしては避けたほうがいいでしょう。凍結を防ぐためにエタノールを加えてフリーザーに保存し、使うときになったらエタノール沈殿で回収するというのもいいでしょう。乾燥沈殿で保存するのは、確かに安定ですがゲノムDNAの場合再溶解が困難になるのでやめたほうがいいですね。

精製度によると思います。
簡易な方法で粗精製したものだと数週間から数ヶ月で明らかな分解が認められることがありますが(それでもPCRには使えるかもしれませんが)、超遠心法、フェノール抽出を慎重に行う、イオン交換カラムで精製などでnucleaseのコンタミを排除しておけば、数年単位の長期間にわたり4℃で分解なく保存できます。
私は最近、3年以上前にQiagenのDNaesyで精製してそのまま4℃で保存したゲノムDNAを使いましたが、電気泳動像に分解は認められずPCRの増幅も良好でした。

長期保存する場合、注...続きを読む

QSDS電気泳動について教えて下さい。

SDS電気泳動ってどういうものなのでしょうか?
検索してみるとタンパク質の変性を加えて用いるということは分かったのですが、
それ以外のことは分かりません。
どなたか詳しい方教えて下さい。 

Aベストアンサー

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲルの「網目」を通過させる(大きいサイズほど流れにくく、小さいサイズのタンパク質は流れやすい)
というものです。網目を通過しやすいかしにくいかでタンパク質の長さを測定します。結果として、ゲルの下の方には小さいタンパク質が、上の方には大きいタンパク質がきます。

SDSで変性させる理由ですが、タンパク質を直鎖状にすることです。タンパク質はその機能を発揮するために特有の立体構造(疎水結合やジスルフィド結合などを利用して)を形成します。タンパク質をそのまま泳動すると、ポリアクリルアミドゲルの「網目の通りやすさ」はタンパク質の長さだけに影響されず、タンパク質の形状(立体構造)にも影響を受けます。

SDS-PAGEを行う場合の多くは、タンパク質の長さだけを知りたいので、タンパク質の立体構造に影響される電気泳動は望ましくありません。そこで、SDSでタンパク質を直鎖状にして電気泳動します。

では、SDSをいれるとなぜ、タンパク質が直鎖状になるか、です。SDSは親水基と疎水基の両方をもつ化合物です。そして、その親水基は負(マイナス)に荷電しています。

タンパク質の立体構造はアミノ酸残基(アラニン、グリシン、リジン、トリプトファン・・・)の性質(特にアミノ酸残基がもつ電荷)の影響を大きく受けます。SDSがタンパク質に作用すると、SDSの疎水基側がタンパク質に親水基側が溶媒側に結合します。このタンパク質に結合したSDSの親水基(マイナスに荷電)がタンパク質を構成する様々なアミノ酸の特性を打ち消してしまいます。結果として、SDSが結合したタンパク質はアミノ酸残基の影響をうけられなくなり直鎖状になります。

また、このようにSDSが結合したタンパク質はマイナスに荷電しますので、電気泳動をするとタンパク質(とSDSの複合体)はマイナスからプラスの方へ泳動されていきます。

最後に、立体構造に大きな影響を与えるジスルフィド結合に関してです。このジスルフィド結合はSDSによって壊されません。そこで、多くのSDS-PAGEを行う場合は、SDSと共に2-mercaptoethanolやDTTといったジスルフィド結合を壊す還元剤で処理したタンパク質を電気泳動します。

なお、立体構造も含めて解析したい場合は、Native PAGEと呼ばれる方法で電気泳動を行います。

まず、SDS電気泳動(多くの場合はSDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresisと言います)をやる目的ですが、タンパク質をサイズの違いで分離する方法です。例えば、細胞の中にはかなりの種類のタンパク質があるため、何かの方法で分離して検出する必要があります。SDS-PAGEでは、この分離を「タンパク質のサイズ(タンパク質の長さ)の違い」で行います。

SDS-PAGEの原理ですが、
1.タンパク質をSDSで変性させる(タンパク質の立体構造が壊れる)
2.電気泳動でタンパク質をポリアクリルアミドゲ...続きを読む


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