痔になりやすい生活習慣とは?

培養細胞のギムザ染色を行っていますが、
なかなか綺麗な染色を行うことができません。

現在は、培養液除去→PBS洗浄→すぐにメタノールで90秒固定→
 PBS洗浄→完全に乾燥→PBSで10倍希釈したギムザ、37度60分→洗浄
でやっています。

多くの参考資料を見ると、
「メタノール固定前に乾燥させる」との記載と、「なるべく乾燥させない」
と両方の記載があり、羊土社の文献にはエタノール固定なる方法が乗っています。

綺麗に培養細胞をギムザで染める際のコツはありますでしょうか?
またメタノール固定前の乾燥の是非はどうなんでしょう?
教えてください。

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A 回答 (2件)

固定前にはPBSで一度リンスしています。

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この回答へのお礼

やはり、むしろ乾燥させない、ということですね?
ありがとうございました。

お礼日時:2008/03/28 13:50

Wako のギムザ液を使って添付のプロトコール通りやってますが、特に問題ないですよ。


http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/life/arti …

主要な違いとしては、
メタノール固定後乾燥しない
ギムザ液は水で希釈
染色は室温
といった点でしょうか。

色々な条件を試したわけではないので、これらの違いがどの程度影響するかは分かりません。
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この回答へのお礼

早速ありがとうございます。
水で希釈した場合と、室温で染色というのは何度か試みたんですが、
固定後すぐギムザというのはやっていませんでした。
固定前の洗浄段階ではいかがでしょう?

お礼日時:2008/03/28 12:59

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しっかりしていれば問題ないですね。
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 その時はP液では洗っていなかったかな。

 楽しくてだいじなお仕事がんばってくださいね。
今でもちょっと見てみたい仕事ですね。
 #1さんもがんばってね。
 ガンセンター、がん研とか逓信病院の教授とメタのことで
だいぶん討議絞られたことを思い出しました。
数をこなし、異常例に出会うことが実力を磨く世界ですね。

 文献にこだわらずベストを!

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メイグリュンワルド内の染色物質は(+)と(-)のどちらにイオン化するのでしょうか?

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HPではないのですが・・・
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Q細胞培養中の継代でのトリプシン処理について、改善方法を教えてください。

現在、接着系ヒト癌細胞を使っております。

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検索サイトで検索かけてみたりしたのですが見つかりません。(ネット上にデータベースがあるというのを聞いたことがあります。)
調べる方法を教えてください。お願いします。

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NCBIの場合
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
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ALDH2がテキストに含まれるデーターのリストが得られると思いますので、適切な物を選択してください
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=217
ここから、Related Sequencesのgenomicを見つけてそのシーケンスを見てもいいのですが非常に長いテキストで、目的のもの以外の配列も入っていることもかなりありますので、右のlinksから、Map viewerに飛びます。
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?taxid=9606&chr=12&query=uid(14218883)&QSTR=217%5Bgene%5Fid%5D&maps=gene_set&cmd=focus

ALDH2 OMIM HGNC sv pr dl ev mm hm sts.... という文字列があると思います。dlをクリックしデーターを取得するページに飛んで Display かSave to Disk データーを得てください。

ほかのデーターベースだと
http://www.ensembl.org/index.html
のhuman
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html
の右上からALDH2検索
詳細は省略します。ひつようであればおっしゃってください。

NCBIの場合
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
seachの選択項目の中からgeneを選びALDH2を検索します

ALDH2がテキストに含まれるデーターのリストが得られると思いますので、適切な物を選択してください
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=gene&cmd=Retrieve&dopt=full_report&list_uids=217
ここから、Related Sequencesのgenomicを見つけてそのシーケンスを見てもいいのですが非常に長いテキストで、目的のもの以外の配列も入っていることもかなりありますので、右のlinksから、Map viewerに...続きを読む

Qウイルスの力価(titer)とは?

ある本を読んでいて「感染者でウイルスの力価が低い」というような記述があったのですが、ウイルスの力価とはどうゆう指標なのでしょうか?
また、力価が低い場合どうゆう意味なのでしょうか?

教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

 具体的にどうやって力価を測定するか説明した方が判りやすいでしょう。

 まず、検体(ウイルスが含まれる液体)を段階希釈します。2倍ずつ段階希釈すると2倍、4倍、8倍、16倍・・・に希釈されたウイルス液ができることになります。10倍ずつなら10倍、100倍、1000倍、10000倍・・・ということになります。

 そしてそれらのウイルス液を、そのウイルスに感受性を持っている(そのウイルスが感染することができる)モノに感染させます。それは培養細胞だったり発育鶏卵だったりします。

 その後、ある一定の期間後にその細胞なり発育鶏卵が「ウイルスに感染しているかどうか」を調べます。
 何をもって「ウイルスが感染しているか」判断するのは、測定方法によりいろいろあるのですが、最も単純な細胞変性効果(CPE)を指標とするのでしたら、判定は細胞を顕微鏡で観察してCPEが起きているかどうかを見るだけです。

 で、最終的には「どの希釈濃度まで"感染"することができたか」という数字がそのウイルスの力価となります。
 その数字の出し方や単位は、ウイルスや手法によっていろいろあります。1つのウイルスでもいろいろな方法で力価を測定できますし。

 例えば、インフルエンザウイルスの力価を測定する方法を2つ挙げてみます。

 1つはこのウイルスが持つ「赤血球凝集能」を利用する方法で、ウイルス液を2段階希釈した液を鶏の赤血球と反応させます。
 例えば64倍希釈した液までが赤血球を凝集し、128倍では凝集しなかった場合、このウイルスの力価は「64単位」という言い方をします。
 この手法(HA法)は、反応時間が1時間ほどと短く、反応させる赤血球もラボで採血用の鶏を飼っていれば採血~赤血球調整まで1時間もあればできてしまうので、たいへん手軽に実施可能です。
 インフルエンザウイルス以外にも赤血球凝集能を持つウイルスはけっこうあるので、比較的多用される力価測定法です。ただ、赤血球ならなんでも良いというわけではなく、「豚の赤血球」でなければならないとか「ヒトのO型の赤血球」とか、ウイルスによっていろいろです。どこまで本当か判りませんが、「鶏ではダメだけど烏骨鶏の赤血球ならうまくいく」みたいなものもあって、変わった動物の赤血球に凝集能を持つウイルスを分離した時は、採血する動物を探すのに苦労します。その動物を飼っているヒトや施設が見つかっても、血液が欲しい理由を説明するのに苦労したりして。(どう説明しても、その動物そのものを検査されると勘違いされてしまう)

 また、インフルエンザウイルスは犬の腎臓細胞に感染能を持っています。この犬の腎臓細胞は"株化"されているものなので、つまり市販されています。
 この犬の腎細胞を培養し、それに10段階希釈したウイルスを感染させ、1週間ほど培養してCPE(細胞変性)が起きているか確認する方法もあります。

 この場合、1種の希釈ウイルス液を4本の試験管(培養細胞)に感染させたとして、10000倍希釈のウイルス液が4本中2本の細胞を変性させたとすると、力価は「10^4TCID50/25uL」という表記になります。これは「10の4乗まで酌したウイルスが50%の細胞に感染した」という意味です。/25uLというのは、96穴プレートで試験する場合は、たいてい1wellあたり25uL(マイクロリットル)のウイルス液を接種するからです。
 上では「試験管」と書きましたが、現在ではたいてい96個の穴(well)が開いたプレートを使います。私が初めてウイルスを習った先生は「対トレーションは試験管でやらねばならぬ!」という信念の人でしたが・・・

 同様にインフルエンザウイルスは発育鶏卵(胎仔がいる受精卵です)にも感染するので、やはり10段階希釈したウイルスを9~11日齢の発育鶏卵の尿腔膜内に接種する方法もあります。判定方法は基本は細胞と同じなのですが、鶏胚が死滅するのを見るのか尿腔液を回収してHAの有無を見るのかといったところです。
 この場合、単位はEID50を使います。「50%の卵に感染する」という意味合いです。
 ちなみに細かいことですが、TCID50もEID50も"50"は下付き文字で表記します。

 細胞の場合、ウイルスによって感受性細胞は異なりますので、ウイルスの検査機関では常に10-20種類の細胞を培養しています。
 株化細胞であれば「買える」のでいいのですが、ウイルスには"初代培養細胞"でないと感染しないものもあります。まあノーマルでは細胞は元の臓器から培養するとせいぜい数代しか保たないのですが、「異常を来して半永久的に継代可能になった細胞」が"株化細胞"です。
 初代培養細胞でないと増えてくれないウイルスも多々あるため、この初代培養細胞は基本的に自分で作るしかないので苦労することになります。
 なのでたまに「妊娠した牛の新鮮な死体」などが手に入ると、いそいそと胎仔を取り出して細胞を作るというわけです。中にはすごくレアな「羊の胎仔肺細胞」なんて細胞を持っている人がいたりして、私がさんざ苦労して分離できなかったウイルスをその人がそのレアな細胞であっさり分離してしまったりすると、ちょっと悔しかったりします。
(ちなみにここで言う「分離」と力価測定は作業的にはほぼ同じです)

 このように、いわばウイルスの力価とは「結果論」なんです。
 「このウイルスはVero細胞で10^4TCID50/25uLの力価だった」という場合、この数字は"このVero細胞との組み合わせ"でしか通用しません。同じウイルスをMDCK細胞に接種すれば10^2しか出ないかもしれませんし、逆に10^8くらい出てしまうかもしれません。
 また、同じVero細胞であってもAというラボとBというラボで培養されているVero細胞が「同じもの」である保証もあまりないです。元は同じ細胞でも、それぞれのラボで何代も何代も継代されていくうち、「別物」になってしまうことはよくありますから。
 また、あるラボで培養されている細胞が、新たにあるウイルスに対する感受性を獲得することもよくあります。そうなるとその細胞は例えば"Vero-Jagar細胞"というように新たに名前が付けられて株化される、というわけです。
 そうすると今まで力価測定が不可能だったウイルスが可能になるわけです。

 つまりNo.2さんの回答に付け加えるなら、「その細胞がそのウイルスに対する感受性が低い」という要因もあるわけです。
 例えばコロナウイルスなど、患者の便中にはけたたましい量のウイルスが存在するのですが、「力価を測定」するとロクな数字が出ません。ノロウイルスに至っては未だ感受性細胞が見つかっていないため、力価測定不能ですし。つまり言い方を変えると、どんな系で試験しても「力価ゼロ」という結果しか得られないわけです。
 「力価は結果論」というのはそういう意味合いです。

 具体的にどうやって力価を測定するか説明した方が判りやすいでしょう。

 まず、検体(ウイルスが含まれる液体)を段階希釈します。2倍ずつ段階希釈すると2倍、4倍、8倍、16倍・・・に希釈されたウイルス液ができることになります。10倍ずつなら10倍、100倍、1000倍、10000倍・・・ということになります。

 そしてそれらのウイルス液を、そのウイルスに感受性を持っている(そのウイルスが感染することができる)モノに感染させます。それは培養細胞だったり発育鶏卵だったりします。

 その後、あ...続きを読む

QDMEM培地について。

DMEM培地に含まれる

・グルコース
・L-グルタミン
・フェノールレッド
・HEPES

それぞれの効果というか意味を教えてください。

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

L-グルタミンについては、
http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8
「培地にL-glutaminの添加は必要ですか?どの程度のL-glutaminを添加したらよいですか?なぜ information sheetにL-glutaminの記載がないのですか?」
を見て頂けると良いと思います。
最終的にはどの培地にも添加されます。

参考URL:http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8

QIC50(50%阻害濃度)の出し方についてご教示ください。

IC50(50%阻害濃度)の出し方についてご教示ください。

とある物質の酵素阻害活性を測定しているのですが、
IC50値の出し方がいまいちわかりません。

現在の実験方法はサンプル毎の阻害率を以下のように求めています。
1.酵素、基質、阻害物質を加え反応させて吸光度を測定
 (反応生成物を比色法で測定しています)
2.得られた吸光度から、ブランクを差し引いて阻害率を求める式にあてはめて
 阻害率(%)を出す
 ((対照-サンプル)/対照)×100

という風に行っていました。
なので、阻害物質の濃度をふって(10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01ug/mL)
それぞれの阻害率を求めて、エクセルで検量線を作って
その式に当てはめて50%の値を求めたらよいのかな、と思ったのですが…
普通に散布図にしたら変な形のグラフになってしまいました。
いろいろ調べた結果、IC50を求めるときはx軸が対数のグラフを作るのでしょうか?
そのとき、阻害物質(x軸)の濃度の振り方も異なってくるのでしょうか?
(たとえば10, 5, 2.5, 1.25, 0.625…のほうが良いとか)

正直、数学が苦手でして対数にする意味などはさっぱりです…
どなたか、ご回答よろしくお願いいたします。

IC50(50%阻害濃度)の出し方についてご教示ください。

とある物質の酵素阻害活性を測定しているのですが、
IC50値の出し方がいまいちわかりません。

現在の実験方法はサンプル毎の阻害率を以下のように求めています。
1.酵素、基質、阻害物質を加え反応させて吸光度を測定
 (反応生成物を比色法で測定しています)
2.得られた吸光度から、ブランクを差し引いて阻害率を求める式にあてはめて
 阻害率(%)を出す
 ((対照-サンプル)/対照)×100

という風に行っていました。
なので、阻...続きを読む

Aベストアンサー

どんなグラフなのかわからないのであれですが

とりあえず、貴方の実験も対数でされているので問題無いです(0.01, 0.1, 1, 10, 0.05, 0.5, 5で実験しているので)
今回の実験をリニア(普通の)軸で取ると、一番右端が10になり左端が0.01≒0になります
真ん中が5、左から1/10が1になるので、右半分は殆どデータがなく左側にばかりデータ点が並ぶことになります
しかも、0.01と0.05, 0.1当たりの違いはグラフで書いて理解するのは困難だと思います
ですので、対数軸を使います
対数軸ですと、0.01と0.1が一目盛、0.1と1が一目盛となるのでデータ点が均一に並びます
あとは、10倍では飛びすぎているので、間の点として5を選んだということで、それぞれの間に5x10^nのデータが並びます

データ点はある程度規則的に並んでいた方が良いですが、厳密に取る必要はないです
(リニア軸でいうと1, 1.6, 2, 2.6, 3, 3.6などでも良い)
ですので今回の濃度のままで問題ないと思います

Q1滴は何mLですか?

常温常圧での水の1滴は何mLですか?教えてください。辞典などで調べても見つからなくて、困ってます。

Aベストアンサー

こんばんは
0.04ml位です。
滴定時にビューレットから落ちる一滴の容量です。

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

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イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む


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