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微生物の実験をしているものです。初歩的な質問なんですが、培地にクロラムフェニコールを添加するとき クロラムフェニコール自体の滅菌はどのように行えばいいのでしょうか?

また クロラムフェニコールは濃度100μg/mlらしいのですが これは水に溶かした値なのですか?

A 回答 (3件)

No.1です。



滅菌済み容器に、滅菌したスパチラで粉末を取り、エタノール(水溶性の抗生物質の場合は滅菌水)で
溶解すれば、フィルター滅菌しなくても特に使用上の問題が生じた事はないですけどね。。

No.2さんの方法に比べると手抜きですが簡便ですので、まあご参考まで。
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クロラムフェニコール(以下CP)は耐熱性があるので、培地に添加した後に加熱滅菌をすることが一般的です。


濃度は培地1Lあたり100mg添加することが多いです。質問者の100μg/mlは、この濃度ですね。
予めエタノールに100mg/mlの濃度でCP溶液を作成しておけば、殺菌前の培地1Lに1mlの割合で添加すれば良いので便利です。

殺菌後に添加する場合は、同じく100mg/mlの濃度の液を作成し、ポアサイズが0.22μmのフィルターで除菌して添加します。
エタノールで溶かしたとしても、その殺菌作用に過度に期待してはいけません。
カビ胞子や細菌芽胞はエタノールで死なないと考えた方が良いです。(細菌についてはCPで抑えられますが、完全ではありません。)

CP以外の抗生物質については耐熱性が弱いものが多く、同じく溶液(水で溶けるもの以外はエタノール液)を作成し、フィルターで除菌して添加します。
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この回答へのお礼

御礼が遅れてすいません

詳しい説明すごく助かりました!!また困ったらよろしくお願いしますw

お礼日時:2008/04/26 21:53

クロラムフェニコールはエタノール溶液で使用しますので、


滅菌不要です。

容器の口を火炎滅菌すると引火しますから注意してください。
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性能が落ちる原因は、
有効成分の劣化(分解)という意味とほぼ同じだと思われるので
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ANo.1の回答には一部間違いがありますので勝手に補足させてもらいます。
そもそも、pUCタイプベクターは青白選択を行うために開発されたベクターですので、まずはその原理を理解されるのがよろしいかと。

まず、pUCタイプベクターなど、α-complementationによる青白選択を行うためのベクターには、lacプロモーター(lacP)、lacオペレーター(lacO)、そしてlacZ遺伝子のα-flagment部分が乗っています。
http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0329

また、青白判定を行う際にホスト株から野生型lacZが発現しては困るので、このような目的に使うホスト株(DH5α、JM109など)は通常ラクトースオペロンを欠失させています。この遺伝子型は出典によって異なりますがおおよそΔ(lac-proAB)やΔ(lacZYA-argF)U169などと表現されます。
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となります。

ANo.1の回答には一部間違いがありますので勝手に補足させてもらいます。
そもそも、pUCタイプベクターは青白選択を行うために開発されたベクターですので、まずはその原理を理解されるのがよろしいかと。

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わかりやすいかもしれません。

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よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Q形質転換効率?の求め方

プラスミドの導入による細菌の形質転換のレポート作成中です。
形質転換効率(cfu/μg)求める式、どなたか教えていただけませんでしょうか??
また、プラスミドによる薬剤耐性化が問題となっている細菌感染症の例には、どのようなものがありますか??レポの提出日、明日なので、誰か助けてください><よろしくおねがいしますmm

Aベストアンサー

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用したプラスミドベクターの重量(ライゲーション産物の場合はベクターの重量のみで、インサートは勘定にいれない)

計算例)
A=150 cfu, B=100 uL, C=1000 uL, D=1 ngとしましょう。

まいた100 uL中に含まれるプラスミド量は
1 ng x 100 uL/1000 uL=0.1 ng

そのプラスミド量で150個のコロニーが出たので、1 ugあたりに換算すると

150 cfu x 1 ug/0.1 ng= 150 cfu x 1 ug/0.0001 ug=1.5x10^6 cfu/ug

となります。単位につくmicro (uであらわしています), nano (n), pico (p)が順に1/1000ずつ小さいことをあらわすのは説明不用ですね。

薬剤耐性化の設問は、日常生活とのかかわりを問うているもので、専門知識よりむしろ新聞の社会欄に出てるような話題を求めているのではないですか。たとえば、院内感染で騒がれているのはどのような感染症でしょう。

形質転換効率の意味を理解していれば、単純な割り算、掛け算です。特に公式のようなものはありません。
パラメータは
A. コロニーの数(プレーティングするを振っていたなら、数十から数百コロニーまいたプレートを採用します。少なすぎるとサンプリングによる振れが大きくなりますし、数えるのが不正確になります。同じ量をまいたプレートが複数ある場合は平均します)。

B. Aを与えたプレーティング細胞の体積
C. プレーティング細胞全体の体積(回復培養のため加えたSOC培地の体積でよろしい)
D. 使用...続きを読む

Q器具のオートクレーブ滅菌について

当方には、乾熱滅菌器はないのですが、オートクレーブはあります。
コンタミが時々起きるので、作業内容を確認しています。
オートクレーブは、缶内の空気を追い出し飽和蒸気で満たす必要があります
器具の滅菌について、空気を効率よく抜くにはどうすればよいでしょうか?
器具は、プラスティックボトル、ピペット、スプーン、シャーレ、メンブランフィルターホルダーです。
現在は、乾燥後、ボトル以外はアルミホイルでくるんで、滅菌し、その後乾燥しています。
ボトルは、ふたを少し緩めて滅菌し、オートクレーブから出して、ふたを閉めています。
滅菌前に乾燥するのはよくないのですが、滅菌後の乾燥時間に余裕がないので困っています。
最近のオートクレーブは、よく自動化されていて、どんな対象物でも空気をうまく抜けるようになっているということはありますか?
もちろん密閉容器は除きますが。

Aベストアンサー

 乾燥までやってくれるようなオートクレーブはうちにもありません・・・

 オートクレーブ後の乾燥時間が足りず、器機に水滴が付着したまま実験に使用しても、それは実験のデータを狂わせるかもしれませんがコンタミの原因にはなりません。

 コンタミの原因は作業手技や作業環境の可能性が最も高く、それらを全て検証して否定された場合に初めて「オートクレーブできちんと滅菌されていないのではないか」ということを疑った方が近道でしょうね。オートクレーブなんて単なる圧力釜ですから、そう簡単におかしくなるものでもないです。

 ただ、液体が入った被滅菌物を缶内容量一杯まで入れていないか、とか、きちんと設定温度まで上がっているか、といった検証は日常的に行っている必要はあると思います。
 インジケーターテープは被滅菌物全てに貼って滅菌していますか?それでちゃんと"Sterilized"の標識が出るのであれば、コンタミの原因に関してはオートクレーブの可能性は捨てて良いと思います。

>器具の滅菌について、空気を効率よく抜くにはどうすればよいでしょうか?

 それはオートクレーブの弁が勝手にやってくれていることなので、仮に弁の具合が良くなくて空気がうまく抜けてくれない時は、エラーが出てオートクレーブが止まってしまうか昇温にやたら時間がかかるようになるだけなので、コンタミの原因として考慮する意味はありません。
 機種によっては、バイオハザード対策モードといって、低温時から空気抜きの弁を閉じたまま昇温させる機能を備えたものがありますが、このモードを使うと昇温に通常の倍近くの時間がかかります。

 アルミホイルでくるむのは、滅菌後の移動や保管時に空中に浮遊する菌によって汚染されるのを防止するためなので、これもコンタミの原因としてはあまり考えられないでしょうね。
 もちろん、アルミホイルで「密閉」してしまえば、その内部は気圧が上がらないので滅菌効果はなくなるのですが、アルミホイルで密閉なんてできるわけもなし、です。
 ボトルの口を少し緩めた程度のほんの僅かな隙間でも、そこから水蒸気が入って器機内部の気圧は結局缶内気圧と同じになるので、きちんと滅菌されます。
 心配でしたら、アルミホイルでくるんだ器機の中にインジケーターテープを貼ってみれば良いです。私はコニカルチューブやガラスボトルの内側にインジケーターテープを貼ってみたことがありますが、きちんとSterilizedの標識が出ました。

 50ml程度の樹脂製コニカルチューブを、キャップの緩め方が甘い状態(けっこうしっかり閉められている)でオートクレーブにかけると、けっこう変形します。
 これは缶内が2気圧になってもチューブ内に水蒸気が回らず、チューブ内外で気圧差が生じているからだと考え、チューブ内にインジケーターテープを貼ってみたのですが、結果はきちんと水蒸気は回っていることを推察できるものでした。
 ちなみにがっちりキャップを閉めると、チューブ内のインジケーターテープはSterilizedの標識が出なかったです。チューブの変形ももっと激しかったですし。

 余談ですが、他にもやってる人は多数いると思いますが、乾熱滅菌をかけるときもオートクレーブ用のインジケーターテープを使っていますが、Sterilizedの標識は出るものの、少し色が薄いです。

 ということなので、アルミホイルでくるむのは滅菌に影響を与えない、と思います。不安なら試してみれば良いと思いますよ。
 むしろ、作業環境や保管場所に問題があるのであれば(その可能性が高いと思いますが)、アルミホイルでくるむのをやめるか、被せる程度にすれば、コンタミは酷くなることが予想できますね。

 他の作業内容、保管場所、作業手技などを疑った方が早道だと思いますよ。

 乾燥までやってくれるようなオートクレーブはうちにもありません・・・

 オートクレーブ後の乾燥時間が足りず、器機に水滴が付着したまま実験に使用しても、それは実験のデータを狂わせるかもしれませんがコンタミの原因にはなりません。

 コンタミの原因は作業手技や作業環境の可能性が最も高く、それらを全て検証して否定された場合に初めて「オートクレーブできちんと滅菌されていないのではないか」ということを疑った方が近道でしょうね。オートクレーブなんて単なる圧力釜ですから、そう簡単におかし...続きを読む

Qクロラムフェニコールの大腸菌への効果について

はじめまして

プラスミドの抽出でプラスミド分子数を増やすのに、タンパク質阻害物質であるクロラムフェニコール【抗生物質】を加えるそうですが、大腸菌の増殖の仕方を探す事が出来ず「何処の段階で阻害」しているのかが分かりません。リボゾームに結合しタンパク質を作れなくするのはわかります、ファージでいるなら殻をつくる時だろうかと思いますが(この場合DNAだけ増えてく…でもファージには入れてません)

ので推測

プラスミドと細胞壁は別々に出来最後に中に入る…なんか違いますねぇ…(ううっ)大腸菌の細胞壁はタンパク質だろうか…たどたどしい質問で申し訳ありませんTT

Aベストアンサー

 すみません、通りすがりなので詳しくは判らないのですが。
 大抵の場合、増殖させたいプラスミドに抗生物質耐性遺伝子が組み込まれています。そして、そのプラスミドにあわせた抗生物質を培養液に入れて培養します。
 するとプラスミドを持った大腸菌は抗生物質耐性遺伝子から作り出される物質のために抗生物質が効きにくくなり増殖することができ、
プラスミドを持たない大腸菌は抗生物質の作用で死滅し、
最終的にはプラスミドを持った大腸菌のみが選択的に普通に増殖していくということでプラスミドを増やしていく原理だったはずです。
 つまり、大腸菌1匹(?)の中でプラスミドがどんどん増えるのが主な増殖方法ではなく(そういうこともあるかもしれませんが私は知りません)、大腸菌群全体でプラスミドを持ったもののみを増やしてプラスミドを抽出する増殖法であるということで理解しています。
 ファージについての知識が私は乏しいのですが、ファージはプラスミドを大腸菌に導入するときに利用することはあっても、増殖するときには関係なかったような気がします。

参考URL:http://www.mls.sci.hiroshima-u.ac.jp/smg/education/ecoli.html

 すみません、通りすがりなので詳しくは判らないのですが。
 大抵の場合、増殖させたいプラスミドに抗生物質耐性遺伝子が組み込まれています。そして、そのプラスミドにあわせた抗生物質を培養液に入れて培養します。
 するとプラスミドを持った大腸菌は抗生物質耐性遺伝子から作り出される物質のために抗生物質が効きにくくなり増殖することができ、
プラスミドを持たない大腸菌は抗生物質の作用で死滅し、
最終的にはプラスミドを持った大腸菌のみが選択的に普通に増殖していくということでプラスミドを...続きを読む

Qエタ沈後のペレットを確実に溶解させるには

プラスミドのTE(pH8)に対する溶解度は高いんですか?

エタ沈後、エタノールを除去するとプラスミドの沈殿が残りますが、
これをTEに溶かすことがあるんですが、どのようにして溶かしたら
いいんですか?
溶解度が高いんならほっとけばいいと思いますが。
エタ沈はWAKOのエタ沈メイトというキットを使っています。

また、大量のエタノールを入れて精製した場合、チューブの壁面に沈殿が付くと思いますが、沈殿後に加えるTEの液料が少ない場合は液に接しない壁面の沈殿はどうやって溶かせばいいですか?
ピペットで落とすしかないんでしょうか?

また、完全に溶解したかどうかはどうやったら確認できますか?
透明になっていれば溶解したということになるんでしょうが。
沈殿自体が見えにくいのでなかなか苦労しています。

Aベストアンサー

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真空乾燥させると、溶液中に回収できずチューブに残る放射活性が非常に高いことがわかります。室温で放置、または37度くらいで穏やかに温めて乾燥させるのがいいです。

2.Mg++が存在するとDNAが非常に溶けにくい塩を作って溶けにくくなります(逆にこれを利用してEtOH沈殿の回収率を高める方法もあります)。これは純水に溶かそうとするときには難儀ですが、TEに溶かすのであればキレートされるのでそれほど問題ではありません。

沈殿を少量の溶媒に溶かすときには、タッピング(チューブの底をはじく)で、溶媒が十分な範囲をなめるようにすると良いでしょう。チューブの性質にもよりますが、沈殿が付いているところは、水はじきが悪くて液が残ります。壁に付いた液が軽くはじいただけできれいに取れるようになったら、溶けていると溶けたと思っていいでしょう。
また、おおよそ10 kb以下の小さなプラスミドならVortexを使ってもかまいません。

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真...続きを読む


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