DNAの抽出方法について。

僕は、次の実験でDNAの抽出を行う予定なんですが、その際に多々疑問点があります。

(1)　タンパク変性のためにSDS(mix soln)を加え、60℃で20分間インキュベートするのですが、泡立てない方がいいんでしょうか。

(2)　70％エタノールでリンスする際にはぺレットは懸濁させた方がいいんでしょうか。それとも、軽くエッペンを上下させるだけでいいんでしょうか。上下させるだけだは全く沈んだぺレットは動かなかったんですが・・・。

No.3 回答者： kainzara 回答日時： 2008/05/28 11:02

1)SDSは細胞膜破壊、60度で20分間インキュベートするのはタンパク変性が目的だと思います。

細胞膜破壊の促進ためにはvortexは行うようプロトコルにあると思いますので一度確認してみてください。
あとvortexは行うのにはSDSに菌を懸濁するためと菌液のムラをなくす為かと。
さらにSDSは界面活性剤でもあるのでvortexをかけると泡立つのは仕方のないことだと思います。

2)これはやる人も好みの問題ではないでしょうか？
エタノールでリンスするのはDNAに付着している残り滓の変性タンパクや
塩析物の除去が目的だと思いますのでエッペン内を浮遊させたほうがいいと私個人は思います。
プロトコルによっては軽くvortexをかけるとか載ってるものもあるくらいですから。
あとDNAはエタノールでは懸濁はしないと思いますよ。
間違って激しくvortexかけたことありますがエタノール内を舞っただけです。

No.2 回答者： noname#160718 回答日時： 2008/05/28 01:08

　私はDNAの抽出は市販のキットを使っているのですが、

　(1)ですが、SDSを加えるところって、普通のプロトコルだとVortexをかけるか激しく振蕩するところでは。キットでもタンパク変性剤ってSDSだったりするのですが、たいていVortexが激しく振れ、と書かれています。
　それは細胞を十分懸濁させないと、例えば細胞100個の塊があったりすると中の細胞まで壊れてくれないからなので、多少DNAがせん断されてもこちらの方が収量は多いでしょう。
　まあたいていのキットには消泡剤も入っているのですが・・・

　いずれにしろ、質問者さんが使っているプロトコル次第です。SDSを入れた後Vortexなどと書かれているのであれば、泡立ちはあまり気にせずしっかりVortexをかけた方が良いでしょう。

　(2)ですが、普通はなかなか「懸濁」はしないと思いますが・・・
　せいぜいペレットがチューブの底から剥がれて浮遊するくらいでは。
　エタノールでリンスする目的から考えれば、せめてペレットは浮かせるべきだとは思うのですが、実際のところどちらでもあまり変わらないと思います。

　ただ、イソプロ沈殿→遠心した段階で明らかに不純物が多く混じっているようなペレットが生じた場合は、エタノール沈殿の際にチューブ底を指で弾くなどしてペレットを浮遊させることを数回繰り返すと、収量は若干下がるのですが純度は明らかに向上します。
　ということは、よほど微量なサンプルからのDNA抽出でない限り、エタ沈の際はペレットを浮かせてVortexでもかけてから遠心、とした方が良好な成績が得られると言うことでしょう。

No.1 回答者： MIYD 回答日時： 2008/05/28 00:21

1)

泡立てるメリットが無いです。泡立てるような操作により、DNAにせん断力が働くとデメリットが生じますので、泡立てないほうがいいでしょう。

2)
流派によります。
懸濁させたほうが脱塩がうまくいくと言う人もいますし、
懸濁させることで収量が落ちるという人もいます。
抽出後のDNAの使用目的と、師匠の発言から判断することをお勧めします。