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mito trackerでミトコンドリアが染色できるそうなのですが
本を読んでも原理がわかりません。mito trackerがどのような物質で
ミトコンドリアの中でどのように変化するか、なんでmito trackerがミトコンドリアに特異的に存在?できるのか。教えてください。
お願いします。

A 回答 (2件)

ミトコンドリアの内膜では、酸素呼吸系の電子伝達回路が働いています。

ここに、その還元型プローブを導入すると、ミトコンドリアの内膜では酸化されて一時的にとどまる性質を利用した蛍光プローブだと思います。

それも多分、シトクロム系の複合体辺りに作用するのではないかと思います。なぜならば、シトクロム系の場合には、電子伝達回路がクローズになっているので、とどまりやすいという性質があるためです。

つまり、その作用によって、酸素呼吸反応をしている細胞の中のミトコンドリアに選択的に働く蛍光色素であると思うのです。

参考:http://www.invitrogen.co.jp/products/molecularpr …
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まずは、


http://host.cc.ntu.edu.tw/biotech/Confocal%20Hom …
を読んで、書かれていないことはメーカーに問い合わせてみましょう。
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Qミトコンドリアを染めるには

培養細胞のミトコンドリアを免疫蛍光染色で染めなくてならない事態に直面しました。
最終的には染めて蛍光顕微鏡で観察しまして写真を取るだけです。

初めてなのですが、1次抗体として何を用いればきれいに染まるのでしょうか?シトクロムCとかでよいのでしょうか?
普通に固定浸透処理して染めるだけで大丈夫でしょうか?

よろしくお願いします。

Aベストアンサー

細胞の状態によってはチトクロームcは細胞質に放出されてしまうので、
cytochrome oxidase IVをミトコンドリアマーカーとして使っているキットもありますね。

後々何をしたいのかはわかりませんが、
私はミトトラッカーで染色後に一次抗体、Alexa488標識2次抗体で染色してました。

QDMEM培地について。

DMEM培地に含まれる

・グルコース
・L-グルタミン
・フェノールレッド
・HEPES

それぞれの効果というか意味を教えてください。

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

L-グルタミンについては、
http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8
「培地にL-glutaminの添加は必要ですか?どの程度のL-glutaminを添加したらよいですか?なぜ information sheetにL-glutaminの記載がないのですか?」
を見て頂けると良いと思います。
最終的にはどの培地にも添加されます。

参考URL:http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8

QプラスミドDNAの抽出法

実験でプラスミドDNAの抽出をアルカリ法によって行いましたが、アルカリ法の原理がわかりません。
自分でも調べてみましたが、原理はわかりませんでした。
原理をココで教えてくれる方、良いHPを知っている方、何か教えていただけると幸いです。

Aベストアンサー

菌を適当なバッファーに再懸濁します(グルコースが入っているのが一般的ですが、浸透圧をあわせるだけで、あまり重要ではありません)。

アルカリとSDSでタンパク質や膜成分を可溶化し溶菌します。同時に大腸菌のゲノムDNAはアルカリ変性して一本鎖状態になります。スーパーコイル状のプラスミドは変性しにくいのでそのまま残ります(プラスミドまで変性しないように冷やしたり、短時間にします)。

そこに酢酸カリウムなどの塩を加えると急激に中和されるのと同時に塩析作用で、タンパク質-SDS複合体と変性DNAを不溶化します(冷やすこと、時間を置くことで沈殿の形成を促します)。これを遠心分離すると上澄みにプラスミドが残ります。

塩を含んだ上澄みにアルコールを加えると溶けていたプラスミドがアルコール沈殿を起こすので、これを遠心分離して沈殿として回収します。70%程度のエタノールで沈殿から塩を洗い流します。

Q擬似体液について教えてください。

擬似体液について、
成分とか、出来れば作り方or購入できるとすればどこで出来るかといったこと教えてください。

Aベストアンサー

タイロード液を参考に教えます。私は実験で一日あたり40リットル程度は使ったので、自分で作りました。

参考URL:http://www.isjpn.co.jp/art/serch-j.htm

Qプラスミド精製の原理

大腸菌からプラスミドを取り出す(精製)の
原理を簡単にいうとどんな感じですか?

今はキアゲンのキットを使っているので
いまいち原理がつかめません。
塩化セシウム、ボイル法とかありますが、
教科書を読んでもいまいちピンきません。

簡単に教えていただけませんか。

Aベストアンサー

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

4.昔は(10年前の記憶だと)、フェノール・クロロホルムで、残りのタンパク質・脂質などを除く。
(脂質はフェノール層へ、DNA・RNAは水層へ、タンパク質は中間層へ分離するので、水層を回収)

5.その後、イソプロパノールでDNA・RNAを沈殿させる。(イソプロパノールでDNAの水和水が取られて、DNAが不溶化して沈殿する)

6・RNA分解酵素でRNAを分解して、もう一度フェノール抽出をして、エタ沈(イソプロと同じ原理)して、その沈殿を回収するとプラスミドDNAが得られる。

キアゲンは、4のところで、カラムにかけると、DNAが樹脂に結合するので、bufferで不要なものを洗い流して、最後にpHを変えると、プラスミドDNAは溶出されてきます。キアゲンのホームページからマニュアルをダウンロードすれば、詳しく書いてありますよ。

1.大腸菌のサスペンションにアルカリ溶液を入れる
(大腸菌の膜が壊れて、タンパクやDNAなどが出てくる。DNAはアルカリで変性して一本鎖になる)

2.酸で中和する
(変性したタンパクなどは析出、長いゲノムDNAは中和で二本鎖に戻ろうするが、長いので絡まって析出。プラスミドDNAは小さいので二本鎖に戻って溶液中に存在)

3.遠心分離して上澄みを回収
(タンパクや絡まったゲノムDNAなどは沈殿、上澄みにあるプラスミドDNAを回収)

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QCell LineとPrimary Cellの違い

こんにちは。細胞培養の初心者です。
素朴な疑問があります。

例えば、同じRatの骨芽細胞でも、
継代培養して不死化させたCell Lineと、Primary Cellでは、細胞の増殖、分化に違いは絶対生じるものなのでしょうか?

Cell Lineはどこか染色体異常を持っているため、In vitroの実験結果を、生体内で起こる反応として考える上で、より確からしいとしていいのは、Primary Cellの方と考えて細胞生物学的によろしいのでしょうか?

基礎中の基礎と思いますが、どなたかご教授いただけたら幸いです。

Aベストアンサー

動物を解剖し、細胞を分離して得た初代培養細胞は、一般的に株化細胞に比べて増殖が遅く、培養を続けると脱分化するなど、培養を維持するのが難しいです。しかしながら、正常性が高く元の臓器と類似した性質をもつという点で重要な位置を占めています。
逆に、特定の性質をもち長く継代可能な細胞を株化細胞といいますが、染色体数は2倍体から異倍体になっています。細胞の性質の保持は株化細胞の方が安定していますが、そのような異常な細胞であることから、必ずしも生体の反応を忠実に反映しているとは限りません。したがって研究内容によって使い分けます。
実験内容によっては、株化細胞のほうが刺激に対するレスポンスが高く、きれいな結果が出ることが多いことから株化細胞に飛びつきがちになりますが、先ほどお話しした通り、実際の生体反応を反映している保障はできませんので、結果を客観的に見る必要があります。
つたない説明ですみません。ご参考になれば幸いです。

Q蛋白の分子量(kDa)を調べる方法

かなり低レベルな質問なのですが、、、、
分からなくて困っています
約750個のアミノ酸からなる蛋白の分子量を知りたいのですが、どうやって調べたらいいのでしょうか?
よろしくお願いします

Aベストアンサー

アミノ酸配列データがあるなら、計算してくれるソフトウェアがあります。市販の遺伝子解析ソフトウェアには必ずついている機能ですが、ウェブ上でできるサイトもあります。たとえば

http://us.expasy.org/tools/pi_tool.html

実験的に調べるなら、SDS-PAGE、ゲルカラムクロマトグラフィ、TOF-MASSなど、材料や精度に応じていろいろ方法があります。

QATP産生阻害薬

ATP産生阻害薬が存在するという話を聞きました。どうやら、その薬はミトコンドリアでのATP産生機構を阻害するようです。

ミトコンドリア産生機構は電子伝達系だと考えているのですが、その阻害薬は電子伝達系のどの過程を阻害しているのですか??そして、そうなることによって細胞はどのようになるのか詳しく教えていただけませんか??

Aベストアンサー

NADH脱水素酵素(複合体I)の阻害剤
ロテノン、アミタール

シトクロムbc1複合体(複合体III)の阻害剤
アンチマイシンA

シトクロームオキシダーゼ(複合体IV)の阻害剤
シアン化合物、一酸化窒素

シアン耐性呼吸末端酸化酵素(AOX)の阻害剤
サリチルヒドロキム酸(SHAM)

ATP合成酵素(複合体V)の阻害剤
オリゴマイシン、DCCD(なんの略称?)、オーロベルチン

※電子伝達系ではマトリックス側から膜間腔へプロトンがくみ出され、その結果生ずるプロトン濃度勾配を利用して複合体VではATPを合成しています(プロトンのくみ出しと共役したATP合成)。このプロトン濃度勾配をうち消す働きをもつ脱共役剤も呼吸を阻害します。例をいくつか示します。
脱共役剤:ジニトロフェノール(DNP)、FCCP、CCCP、SF6847(最後の3つはなんの略かしりません)


もっとも有名なものはやはり青酸カリに代表されるシアン化合物だと思いますが、それによって阻害されない代替的な電子伝達経路の末端に位置する酵素がAOXと呼ばれるものです。いずれの阻害剤も呼吸代謝のメカニズムを調べる研究において重要な材料といえます。

参考URL:http://133.100.212.50/~bc1/Biochem/oxidphos.htm

NADH脱水素酵素(複合体I)の阻害剤
ロテノン、アミタール

シトクロムbc1複合体(複合体III)の阻害剤
アンチマイシンA

シトクロームオキシダーゼ(複合体IV)の阻害剤
シアン化合物、一酸化窒素

シアン耐性呼吸末端酸化酵素(AOX)の阻害剤
サリチルヒドロキム酸(SHAM)

ATP合成酵素(複合体V)の阻害剤
オリゴマイシン、DCCD(なんの略称?)、オーロベルチン

※電子伝達系ではマトリックス側から膜間腔へプロトンがくみ出され、その結果生ずるプロトン濃度勾配を利用して複合体VではATPを...続きを読む

Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。
お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけると
わかりやすいかもしれません。

また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む

Qエクセルで計算すると2.43E-19などと表示される。Eとは何ですか?

よろしくお願いします。
エクセルの回帰分析をすると有意水準で2.43E-19などと表示されますが
Eとは何でしょうか?

また、回帰分析の数字の意味が良く分からないのですが、
皆さんは独学されましたか?それとも講座などをうけたのでしょうか?

回帰分析でR2(決定係数)しかみていないのですが
どうすれば回帰分析が分かるようになるのでしょうか?
本を読んだのですがいまいち難しくて分かりません。
教えてください。
よろしくお願いします。

Aベストアンサー

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるための指数表記のことですよ。
・よって、『2.43E-19』とは?
 2.43×1/(10の19乗)で、
 2.43×1/10000000000000000000となり、
 2.43×0.0000000000000000001だから、
 0.000000000000000000243という数値を意味します。

補足:
・E+数値は 10、100、1000 という大きい数を表します。
・E-数値は 0.1、0.01、0.001 という小さい数を表します。
・数学では『2.43×10』の次に、小さい数字で上に『19』と表示します。→http://ja.wikipedia.org/wiki/%E6%8C%87%E6%95%B0%E8%A1%A8%E8%A8%98
・最後に『回帰分析』とは何?下の『参考URL』をどうぞ。→『数学』カテゴリで質問してみては?

参考URL:http://ja.wikipedia.org/wiki/%E5%9B%9E%E5%B8%B0%E5%88%86%E6%9E%90

★回答
・最初に『回帰分析』をここで説明するのは少し大変なので『E』のみ説明します。
・回答者 No.1 ~ No.3 さんと同じく『指数表記』の『Exponent』ですよ。
・『指数』って分かりますか?
・10→1.0E+1(1.0×10の1乗)→×10倍
・100→1.0E+2(1.0×10の2乗)→×100倍
・1000→1.0E+3(1.0×10の3乗)→×1000倍
・0.1→1.0E-1(1.0×1/10の1乗)→×1/10倍→÷10
・0.01→1.0E-2(1.0×1/10の2乗)→×1/100倍→÷100
・0.001→1.0E-3(1.0×1/10の3乗)→×1/1000倍→÷1000
・になります。ようするに 10 を n 乗すると元の数字になるた...続きを読む


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