プラスミドDNAを電気泳動する時と吸光度測定した時との濃度差について。

土壌に含まれる微生物を特定する研究をしており、PCRを行うために細菌よりプラスミドDNAを取り出し、取れたか確認のために電気泳動を行いました。
ゲルは、1％のアガロースゲルを用い、ゲル作成時に使用した溶液と電気泳動の際のバッファー溶液は1×TAEを使用しました。

1ヶ月ほど前にプラスミドDNAを抽出し、電気泳動を行い、エチジウムブロマイドで染色、紫外線を当て観察すると、23000bp付近にバンドが確認出来ました。
このときの濃度を吸光光度測定で計測すると、DNAの量は650μg/mlでした。

ところが最近、前回と同じ操作でDNA抽出をしたのですが、今回の場合、電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色をし、紫外線を当て観察すると、前回よりもバンドの蛍光は強くなっていました。
しかし、このときの濃度を吸光光度測定で計測すると、DNAの濃度は200μg/mlまで低くなっていました。

なぜ、このように電気泳動をした時の蛍光が強くなったにもかかわらず、DNAの濃度は下がってしまったのでしょうか？
マーカーの蛍光は、前回と同じように見えました。

また、このサンプルを用いてPCR操作を行う事は出来るのでしょうか？

本を調べ、アルカリや酸で加水分解されると核酸はモノヌクレオチドになり、260nmの吸光度は高分子核酸に比べて10～15％増加するという事は分かったのですが、これが決定的な原因では無いと思います。

原因の予想がつく方がいらっしゃるなら、教えていただけると幸いです。

No.3 ベストアンサー 回答者： am52 回答日時： 2008/11/19 17:51

御自分で調べられているように、プラスミドDNAは、閉環状、開環状、直鎖状の形を取りますので、それにより濃度があてにならないと指導教官からアドバイスを貰ったことがあります。

詳しく調べていないので分かりませんが、吸光度測定での濃度と、ラダーとの光り方から推測する濃度が一致しないのもそのためだと思っていました。

また、他の方も回答なさっているように、純度の問題・機器の問題もあると思います。

なので、私は濃度だけで言えばどちらかと言えば、電気泳動から推測される濃度の方をあてにしています。
ラダーとサンプルのアプライ量とバンドの輝き方から推測出来ますので、今後はそちらも見てみてはどうかと思います。

PCRについては、純度の問題もありますが大丈夫だと思います。
私は、クローニングの際にコンピテントセルからプラスミドDNAを抽出しています。
電気泳動の結果と、吸光度測定での濃度に差があるときでも十分使用できています。ただ、DNAのtemplate量が考えにくいだけで…。

RNase処理とプラスミドDNAの構造の関係は、申し訳ありませんがわかりません。

この回答へのお礼

お礼が遅くなって申し訳ありません。

今のところ、閉環状、開環状、直鎖状の違いが主な原因と考えています。

アドバイス頂き、ありがとうございました。

お礼日時：2008/11/28 21:33

No.2 回答者： dolphino 回答日時： 2008/11/18 00:10

単純に考えると、前回より今回の方が純度が高いでしょう。

PCRはコロニーPCRという、雑な方法もあるのですから、多少の純度は影響しません。とは言っても、純度の低いものを無駄に多く入れると綺麗な増幅は得られません。

吸光度測定に関しては分光器の性能、キュベットのタイプ、メンテナンスの状態によりひどいことがあります。特に100マイクロ程度のキュベットで低い吸光度から計算したものは要注意です。キュベットの出し入れだけで動く装置もあります。これは次の時に試してみてください。適切なキュベットホルダー、光の太さなど重要です。

また、マーカーと比較してゲルからも概算できますよね？その値はどうですか？この時にバンドが強すぎて飽和しているとあまりあてになりません。

この回答への補足

自分なりに本を調べて考えてみたのですが、closed circular DNAというものと、open circular DNAと言うものの違いでは？と思うようになりました。

この2つは、同じプラスミドでも”open circular DNA”の場合は”closed circular DNA”よりもエチジウムブロミドなどの色素がより多くDNA内に取り込まれるのだそうです。

おそらく今回のプラスミドが、”open circular DNA”になったのでは？という風に考えています。

原因としては、前回RNase処理をした時は、濃度0.02mg/mlで1時間ほど処理をしたのですが、今回は濃度0.0025mg/mlにて一晩、処理をしたことが係わっているのでは・・と思うようになってきました。

ですが、長時間RNase処理を行うことにより、プラスミドDNAがこのように”open circular DNA”に変化すると言うことはあり得るのでしょうか？

もし、詳しい方がおられましたら、ご回答いただけると助かります。

補足日時：2008/11/18 22:11

この回答へのお礼

回答していただき、ありがとうございます。
分光器やキュベットは、同じ装置を使って実験をしている人がいるのですが、問題無く実験が進んでいるようなので可能性は低いような気がします。
マーカーの濃度については、申し訳ありませんがそこまで把握は出来ていません、すいません。
バンドが強すぎる、ということは無いのではと思います。

お礼日時：2008/11/18 22:10

No.1 回答者： MIYD 回答日時： 2008/11/17 23:37

>DNAの濃度は下がってしまったのでしょうか？

前回のサンプルでは、RNAが残っていたのでは？
マーカーの蛍光強度を元に、目的のバンドの定量を行いましょう。
あなたが安定してきれいなDNAを精製できるようになるまでは、
吸光光度計での測定値なんてあてになりません。

>このサンプルを用いてPCR操作を行う事は出来るのでしょうか？
RNAのコンタミであれば、それほどPCRには悪影響はありません。
ただ、他に260nmに吸光のある物質が混入している場合、
PCRには使えないかもしれません。

この回答へのお礼

回答、ありがとうございました。
前回のサンプルでRNAが残っていた可能性は捨てきれないと思います。
参考として、考えさせていただきます。

お礼日時：2008/11/18 21:51