ウエスタンブロティング

ウエスタンがどうもうまくいきません。
最終的に発色させると、バックグラウンドのみが発色し、タンパク部分が白く浮き出てきてしまいます。タンパク量の問題なのかと考え、0.25、0.5、１、３、５、10、20μgで試してみましたが、タンパク量に関係なく同様の結果になってしまいました。
一次抗体は100倍希釈(濃すぎでしょうか？)、二次抗体は、500倍、1500倍、2500倍希釈で試しましたが、いずれも同様の結果です。
ブロッキングの回数やブロッキング剤の問題でしょうか・・・。
同じような経験のある方、またその問題を解決された方、アドバイスよろしくお願いします。

No.6 ベストアンサー 回答者： otx 回答日時： 2009/10/28 14:22

発色液は複数の溶液を混ぜて使用するタイプのものではないでしょうか。

混ぜてから、即使うのがいいと思います。
学生の中にやたらと検出感度が低い者がいたことがありましたが、
その学生は、混ぜてしばらく置きっぱなしにして使ってました。

参考までに。

この回答への補足

発色液には、
トリス、NaCl、Tween20、MeOH、H2O2、クロロナフトールが含まれていますが、クロロナフトールは発色させる10分ほど前にMeOHに溶かして暗所で保存するという形で用意しています。トリス、NaCl、Tween20はあらかじめ組成を合わせてストック液として用意してあるものを使用しています。
直前に用意しておいた２種の液とH2O2を合わせて軽くup downして混合し、すばやく膜にかける、という感じです。

補足日時：2009/10/28 15:05

No.8 回答者： Dr_Hyper 回答日時： 2009/10/30 01:13

使用している溶液のpHの問題ですね。

もちろん極端な変化は論外として、pH 6.8とかでもたとえばFLAG抗体などはかなり影響を受けます。
ご存じの通りアミノ酸にはpHによってチャージが変化する物がありますよね。そうするとpHがすこし変わっただけで抗体からすると抗原が違うアミノ酸に見えてしまいます。
（専門家のかた、すみません正確性に欠けますが感覚的な表現をお許しください）おそらくご使用になられている一次抗体はこのようなアミノ酸を抗原にもつ抗体であるためにbufferやブロッキング溶液のpHに感受性が高いのだと思います。そのようなアミノ酸を認識しない場合にはｐＨによって抗原抗体反応がそれほど阻害されるはずはないというのが一般論ですので、protocol集などでも見過ごされることが多いです。このような酸性に傾いているばあいにはTris pH7.4-8.0などを10mMほど入れてやると簡単に戻りますので一度試してみてください。

この回答への補足

すみません、あと、一次抗体や二次抗体を希釈する際に用いていたBufferのpHも同様に塩基性だったのですが、これが原因で抗体が分解してしまうようなことがあるでしょうか。
指摘されたあと、すぐにpH調整したのですが・・・

補足日時：2009/10/30 10:40

この回答へのお礼

ありがとうございます。
さっそく試してみます！

お礼日時：2009/10/30 09:50

No.7 回答者： r_celery 回答日時： 2009/10/29 13:45

写真を拝見しても白く抜けている部分がシグナルなのかどうかがいま一つ分かりませんが、そうだとして回答します。

シグナルの出る部分の色が抜けて、バックグラウンドが高くなるのは1次抗体濃度が高すぎるときに見られます。理由はよく分かりませんのであくまで経験的に、ですが。
自分だったら今100倍希釈している抗体を1000倍や3000倍などにしてみます。2次抗体は市販のものでしょうか？　そうであれば説明書に従うべきですが、あまり濃度を振ってもこの場合には意味が無いと思います。ブロッキングに何を使われているのか分かりませんが、ブロッキングのせいでもないように思われます。

ちなみに、同じことはサザンやノーザンの際にプローブ濃度が高すぎるときにも起こります。この場合にも加えるプローブ量を減らすことで対処します。

この回答への補足

ありがとうございます。
参考にさせていただきます。
それから!!今日判明したのですが、使用しているブロッキングの溶液などのpHがだいぶ塩基性に傾いていました。このことは何か抗体に影響があるでしょうか。
本来ならば中性付近にして使用するはずなのですが。
抗体の寿命にも影響を与えますか？？

補足日時：2009/10/29 19:35

No.5 回答者： Dr_Hyper 回答日時： 2009/10/28 01:00

私の感覚ではブロッキング云々の問題というのは、ちょっと違うかなと思います。

とんでもない物をとんでもない濃度で使っているというのであれば別ですが、スキムミルクを５％でつかっても反応する物はちゃんと抗原抗体反応をしめします。
転写はうまくいっていると仮定して、白く抜けているのがそうだというのでしたらね。一次抗体、二次抗体、そしてHRP活性の検出を確かめないといけませんね。さてこのHRPの反応は他の方が使用してうまくいっている物をご使用ですか？それともそれも保証が無い？二次抗体に着いているHRPのことも含めて確認するには、このメンブレンにダイレクトに二次抗体を100-10000倍程度に希釈した溶液を直接スポットして、軽く洗ってから反応駅を入れて検出してみてください。
これでまったく何も出なければ二次抗体か反応の問題でしょう。
これがうまくいけばつぎに一次抗体を希釈してすぽっとして二次抗体処理、化学反応です。
それでもうまくいけば今度は目的のタンパク質をスポッとしてください。
これでどの段階かわかります。
ご参考までに。

この回答への補足

アドバイスありがとうございます。
画像の実験のときは、メンブレンにタンパクを直接うっているので転写といより、メンブレンには必ず抗原タンパクがある状態です。
以前行った実験では…
二次抗体をメンブレンに直接うって発色液をかけてみたところ、即発色が確認できました。
次に一次抗体をメンブレンにうち、ブロッキングした後、二次抗体を反応させ(500、1500、2500希釈)、発色まで確認したところ、この３種の希釈だと、発色が確認できました。
ここまではＯＫだと思い、次に抗原タンパクをメンブレンに直接うち、ブロッキング→一次抗体→二次抗体→発色と進めていくと、ここで発色がなくなり、画像のような結果になってしまいます。
ここまでの結果から、一次抗体が抗原タンパクに結合していないのではないか、という結論なのですが、たまにきちんと発色したりするのでよく分からない状況です。
しかも一次抗体は３ヶ月前に購入したもので、まだ数回しか使っていないため、おかしくなっているとは考えにくい…といより考えたくないのですが(笑)…。

補足日時：2009/10/28 10:28

No.4 回答者： otx 回答日時： 2009/10/27 23:14

ブロッキングはメンブレンに非特異に抗体が結合しないようにするものですよね？

言い換えると、メンブレンに抗体が非特異的に結合する前に他のタンパク質を結合させておけ、ってことです。

つまり、ある程度非特異的にタンパク質が結合するメンブレンに目的のタンパク質という「タンパク質」が既に結合しているのですから、
何も結合していないメンブレンよりも抗体が非特異的に結合する場所が少ないということです。（もちろん抗体が機能していない前提です）

この回答へのお礼

ありがとうございます。

お礼日時：2009/10/28 10:27

No.3 回答者： otx 回答日時： 2009/10/27 18:05

全くうまくいっていない結果だと思います。

白く抜けているので、何かしらシグナルが出ているのにと思われる思われるのかもしれませんが。

これは結構発色時間が長いのではないでしょうか？
経験的にですが、全くうまくいっていないときにこうなります。

裏付けはないですが、私はこういう時次のように想像しています。

目的のタンパク質をプロットしたことによってメンブレンに他のタンパク質が付かない、
つまり、目的のタンパク質がブロッキング剤としてメンブレンに２次抗体が付くのをブロックしている、と。

簡単に言うと、全く１次抗体がworkしていないように思います。

むしろ、同じタンパク質でたまにうまくいくというのはどういう結果か？
というほど、私には見事にうまくいっていない結果に見えます。

私なら１次抗体、本当にポジコンになりうるサンプルなのか？と疑います。あとはよくわかりません。

この回答への補足

お礼の文を載せた後に気になることがあったので、順序は逆になってしまいましたが、補足で質問させてください。

目的のタンパク質をプロットしたことによってメンブレンに他のタンパク質が付かない、つまり、目的のタンパク質がブロッキング剤としてメンブレンに２次抗体が付くのをブロックしている、と。

このようにありますが、経験不足と勉強不足のため、理解ができませんでした。膜にブロットした目的タンパク自信が二次抗体の結合をブロッキングしているということでしょうか。それとも一次抗体をブロッキングしていて、その後の二次抗体は必然的に結合できていないということですか。ポジコンでもそのようなことが起こり得るのでしょうか…

補足日時：2009/10/27 19:00

この回答へのお礼

ご指摘ありがとうございます。
本来の結果としては白く抜けているところが紫色に発色し、バックグラウンドは白いはずなのです。
このように失敗するときはだいたい発色時間にして15分くらいです。
一次抗体が全く機能していないというのは私も考えてみたのですが…。
抗体について調べなおしてみます。
ご意見ありがとうございました。

お礼日時：2009/10/27 18:59

No.2 回答者： otx 回答日時： 2009/10/27 10:56

どんな系で発色を行っているのか？

何で結果を得ているのか？（写真？取り込み？）
そもそも使える一次抗体という情報があるのか？

これらをあげてもらえればもっとアドバイスできるかもしれません。

この回答への補足

結果はドットブロットですが、写真を貼り付けてみました。
二次抗体はHRP標識でH2O2とクロロナフトールを添加して、酸化クロロナフトールによる発色をみています。
写真はポジコンなので、必ず発色するはずなのですが・・・
たまにうまくいくときもあるのですが、再現ができなくて悩んでいます。
白く抜けているところが全てポジコンのタンパクで、タンパク量は左上から、0.25、0.5、１、３、５、10、20μgです。

補足日時：2009/10/27 12:21

No.1 回答者： otx 回答日時： 2009/10/26 18:20

＞バックグラウンドのみが発色し、タンパク部分が白く浮き出てきてしまいます。

これは、目的のバンドが白く浮き出ているのでしょうか？（黒かったらウエスタンの結果として申し分ない）
それとも、非特異的な沢山のバンドがすべて白く浮き出ているのでしょうか？

一次抗体のデータシートでは何倍希釈を推奨していますか？

他のことは、どのようなウエスタンのやり方をしているのかわかりませんので（発色系、ブロッキング剤）、何とも言えません。

ただ、検出されるバンドが濃いすぎる場合、白く抜ける場合はあります。
そんなときはバンドが濃くなる要因に対して策を練ります。

・タンパク質量が多すぎる（目的のタンパク質の量、です
　全体のタンパク質量ではないです。過剰発現とかによくある）
・抗体が濃すぎる
・ブロッキングがうまくいっていない
・検出感度が高すぎる
・検出時間が長過ぎる
などなど、です。

この回答への補足

白く浮き出る、とは、特異的・非特異的バンドも含めて全てのバンドが白く浮き上がるということです。
目的タンパクの量、二次抗体の希釈倍率は数種類試したのですが・・・。
一次抗体の希釈倍率をふってみます。
アドバイスありがとうございました。

補足日時：2009/10/27 10:23