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基本的な質問で申し訳ありません。
現在、96wellプレートでHeLa細胞の増殖曲線を描こうとしています

最初の1,2日目は比較的きれいにはがれるのですが、その後日を経るにつれてはがれが悪くなってしまい、きれいにはがすことが出来ず、正確な数が測定出来ない状態です。

プロトコールとしては、培地を除去した後に、20μlの0.05%トリプシンを処理後、37℃で3分間インキュベートし、その後80μlの培地を入れてピペッティングを行うことではがしています。(ちなみに20μlではwell全体にいきわたっておらずそれも原因の一つかと考えております。)


もともとトータルの液量もあまり多くないため、全体をはがそうとして、ピペッティングの回数を増やしますと、泡だってしまうのでそれもどうにか避けたい状況です。


96wellプレートで、細胞の良いはがし方がありましたら教えていただけると光栄です。宜しくお願いいたします。

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A 回答 (2件)

>培地を除去した後に、20μlの0.05%トリプシンを処理後、37℃で3分間インキュベートし、



PBSで1度、もしくは2度洗ってみてください。インキュベートは10分くらいでもいいです。いずれにせよ、顕微鏡下で、完全にはがれていることを確認します。

>その後80μlの培地を入れてピペッティングを行うことではがしています。

PBSを代わりに入れてみてください。
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この回答へのお礼

回答していただきありがとうございます。
washを行った後で、PBSではがしてみたいと思います。

ありがとうございました。

お礼日時:2010/02/03 23:41

>20μlではwell全体にいきわたっておらずそれも原因の一つかと考えております


一度全体にいきわたる量のトリプシンで浸したあと、取り除いて20μlのトリプシンを入れてみてください。
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この回答へのお礼

なるほど、全体に一度いきわたらせてから20μlで処理するということですね。

ありがとうございます。参考にさせて頂きます。

お礼日時:2010/02/04 13:34

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現在、接着系ヒト癌細胞を使っております。

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遠心をして、トリプシン溶液を除いて培養液中でピペッティングしても細胞塊状態で、細胞がバラバラになってくれません。

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Aベストアンサー

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参考URLですが日本組織培養学会の細胞培養に関する質問掲示板です。
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参考URL:http://jtca.dokkyomed.ac.jp/JTCA/QA/index-SS.html

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Aベストアンサー

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QIC50(50%阻害濃度)の出し方についてご教示ください。

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どんなグラフなのかわからないのであれですが

とりあえず、貴方の実験も対数でされているので問題無いです(0.01, 0.1, 1, 10, 0.05, 0.5, 5で実験しているので)
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Q限界希釈法について

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また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
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よろしくお願いいたします。

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pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

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Q培養細胞へのトランスフェクション時の培養ボリューム

ヒトの培養細胞を使ってsiRNA実験(メーカーによりすでに効果が確認されているコントロールsiRNA)を行っているのですが、96穴プレートでは効果が低い(40~50%減)のですが、48穴プレートでは効果が高い(70~80%減)傾向があります。おそらくトランスフェクション効率の問題だと思うのですが、培養ボリュームによって差が出ることってあるのでしょうか。培地、試薬、細胞数は同じロットのものをウェルの培養面積の変化と同じ割合で量を変えています。プレートのメーカーは違うのですが表面加工は同じです。トランスフェクション後48時間で見てます。細胞はHepG2です。そんなに使いにくい細胞ではないと思うのですが。

また以前に行ったルシフェラーゼアッセイのプラスミドを入れる実験でも同じように培養ボリュームでトランスフェクション効率が変わるような印象をもっています。このときもHepG2ですが。

おそらくどこか実験系にミスがあるのだろうとは思うのですが、どこをどうしたらよいのかわかりません。

培養ボリュームの違いによる結果の違いについて、同じような経験をされた方、聞いたことがある方、何かご存知でしたら教えてください。

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Aベストアンサー

もう回答も複数寄せられているようですので、私も思いつくことをいくつか。
ポイントになるのはやはりトランスフェクション効率、というか細胞密度が原因だと思います。
実験をしていると感じていると思いますが、96-well plateで均一に細胞をまくことは結構難しく、どうしても中心に寄ってしまうからです。
siRNAを行う際、検体数の多いときは私も96-well plateを予備実験に使うことはありますが、本データは6-well plate以上の大きさでやっています。理由は96-wellでは均一にまくことが難しく、細胞密度が高くコンフルエントな中心部分ではトランスフェクション効率が下がり、結果がばらつくからです。もちろん、コストも飛躍的に上がりますが(笑) どうしても、多穴プレートでやる場合は、wellの外周部分にピペットで滴下するように細胞をまき(中心部にはまかない)、揺らさないようにするのが、コツといえばコツでしょうか。何回かやってみるとある程度は改善されますが、やはり10cm dishのような均一さを出すのは難しいです。

また、トランスフェクション効率そのものを確認したいのでしたら、蛍光のついたsiRNAなんかを購入してトランスフェクションするのも一つの方法です。細胞をばらして顕微鏡で観察すればどの程度の細胞に導入されているかが視覚的に確認することができます。

もう回答も複数寄せられているようですので、私も思いつくことをいくつか。
ポイントになるのはやはりトランスフェクション効率、というか細胞密度が原因だと思います。
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QDMEM培地について。

DMEM培地に含まれる

・グルコース
・L-グルタミン
・フェノールレッド
・HEPES

それぞれの効果というか意味を教えてください。

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

L-グルタミンについては、
http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8
「培地にL-glutaminの添加は必要ですか?どの程度のL-glutaminを添加したらよいですか?なぜ information sheetにL-glutaminの記載がないのですか?」
を見て頂けると良いと思います。
最終的にはどの培地にも添加されます。

参考URL:http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8

Q相関係数についてくるP値とは何ですか?

相関係数についてくるP値の意味がわかりません。

r=0.90 (P<0.001)

P=0.05で相関がない

という表現は何を意味しているのでしょうか?
またMS Excelを使ってのP値の計算方法を教えてください。

よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

pは確率(probability)のpです。全く相関のない数字を組み合わせたときにそのr値が出る確率をあらわしています。

統計・確率には100%言い切れることはまずありません。というか100%言い切れるのなら統計・確率を使う必要は有りません。
例えばサイコロを5回振って全て同じ目が出る確率は0.08%です。そんな時、そのサイコロを不良品(イカサマ?)と結論つけるとわずかに間違っている可能性が残っています。ただ、それが5%以下ならp=0.05でそのサイコロは正常ではないと結論付けます。
それが危険率です。(この場合はp=0.1%でもいいと思いますが)
相関係数においても相関の有無を結論つけるにはそのrが偶然出る確率を出すか、5%の確率ならrがどれぐらいの値が出るかを知っておく必要が有ります。

>r=0.90 (P<0.001)

相関係数は0.90と計算された。相関がないのに偶然r=0.90 となる確率は0.001以下だと言ってます。

>P=0.05で相関がない

相関がないと結論。(間違っている確率は5%以下)だと言ってます。

エクセルでの計算ですが、まず関数CORRELを使ってr値を出します。xデータがA1からA10に、yデータがB1からB10に入っているとして

r=CORREL(A1:A10,B1:B10)

次にそのr値をt値に変換します。

t=r*(n-2)^0.5/(1-r^2)^0.5

ここでnは組みデータの数です。((x1,y1),(x2,y2),・・・(xn,yn))
最後に関数TDISTで確率に変換します。両側です。

p=TDIST(t値,n-2,2)

もっと簡単な方法があるかも知れませんが、私ならこう計算します。(アドインの分析ツールを使う以外は)

pは確率(probability)のpです。全く相関のない数字を組み合わせたときにそのr値が出る確率をあらわしています。

統計・確率には100%言い切れることはまずありません。というか100%言い切れるのなら統計・確率を使う必要は有りません。
例えばサイコロを5回振って全て同じ目が出る確率は0.08%です。そんな時、そのサイコロを不良品(イカサマ?)と結論つけるとわずかに間違っている可能性が残っています。ただ、それが5%以下ならp=0.05でそのサイコロは正常ではないと結論付けます。
それが危険率です。(この場...続きを読む

QG418の濃度(セレクション)

これからネオマイシン耐性のプラスミドを導入してセレクションを行うために、プラスミド導入前の細胞がどの程度のG418濃度でアポトーシスが誘導される検討を行っているのですが、力価として3000 μg/mLまで濃度を上げましたが全然死んでくれません。

細胞は株化された血管内皮細胞なんですが、wakoの試薬情報では哺乳系細胞では100~2000 μg/mLとなっています。

今後、G418濃度を上げ続けてセレクションするのがよいのか、それともいっそのこと耐性遺伝子を変えてしまうのがよいのか迷っています。

どなたかアドバイスよろしくお願いします。

Aベストアンサー

ほとんどの細胞はある程度のG418を加えると、細胞分裂が遅くなります、経験上。
それを考慮にいれて1週間くらい継代なしで培養できるくらいの細胞数ではじめます。
しかし、あまりに少なすぎると、通常の濃度よりも低いところで死にやすくなりますのでご注意を。

もともと、遺伝子を導入した細胞をセレクションする場合、セレクションられた細胞が増えるまでの期間が2~3週間かかりますので、それを想定して1週間くらいで死ぬ薬剤の量を継代なしで検証する必要があります。

継代するとその行為で細胞が痛みますので、正確な検証ができません。
独学とのことですが、こういう実験はやったことある方に、実際に細胞を見せてもらいながら教えてもらうことが重要です。

Q限界希釈法について

私はいま、KO細胞を作成しています。方法としてはKOコンストラクトを用いてエレクトロポレーションで細胞に導入していますが、遺伝子破壊株を単離出来ていません。
そこで限界希釈法をするのですがどう希釈するか悩んでいます。
流れとしては、細胞を5×10^6集めてエレクトロポレーションによりKOコンストラクトを導入しています。
この時点で生き残る細胞数は予備実験から60細胞とわかっています。
これを1ml中に1細胞になるように限界希釈をしようと考えてます。
どのように希釈をすれば効率がよいでしょうか?
アドバイスをお願いします。

Aベストアンサー

 

 普通の培養細胞で「限界希釈」するならかなり少なめにしてから100 ulづつ程度96wellに播種してある程度培養してから単一のクローンが入っているwellを確認するといった形になります。 まあコツとしては「1/2 cells/ ml (well?)」ぐらいを目安に、実際の欲しい量よりも少なめに計算して薄めます。そうしないと意外と複数はいったものができてしまうからです。薄め方も一度に1/1000とかよりも/100から1/10程度で段階的にやったほうが上手くいく気がします。この場合当然入っていない場所もできるのですが、複数入るよりはマシでしょう。60/60でそれぞれ完全に分けて入れることは基本的には無理です。

 ただ、自分自身ESとかをあつかったことはないのですが、ESの場合はコロニーをチップですってそのまま移すとかでやるのが多いのではないのですか?


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