Km値の求め方がわからなくてとても困っています。

Km値の求め方がわからなくてとても困っています。

乳酸脱水素酵素活性の測定という実験をしました。
リン酸緩衝液、ピルビン酸ナトリウム、NADH、ネズミの肝臓のホモジネートが入った溶液の吸光度を15秒間ごとに測り、吸光度の減少率（ΔA/min）を求めた。
減少率は0.416でした。
酵素活性（反応速度）は0.02×10＾6となりました。
ホモジネートのたんぱく質濃度は1.34
酵素の比活性は14.97でした。

この結果からKｍ値を求めないといけないんですが、まったく計算の仕方がわかりません。
ラインウェーバーバークのプロットが検索でひっかかるのですが、どの値を使えば求められるかわかりません、
ラインウェーバーバークのプロットで求めることができるのかもわかりません。

どなたか分かる方、教えてください。
お願いします。

No.3 回答者： c80s3xxx 回答日時： 2010/07/04 22:29

誰がなんといおうと，その実験結果から Km 値は求められませんし，こうやれば求められるとかいう方法は，基本的に間違いです．

もちろん，他の実験からわかっていることを併用していいなら話は別ですが，Vmax がわかっているとかでないとだめですね．

Michaelis-Menten 式には，速度と基質濃度を関係づけるためのパラメータが二つあるのです．その二つのパラメータを，ひとつの実験条件だけから決定することは，数学の論理としてありえません．
もっとも，それとは別に LDH に Michaelis-Menten 式を使えるのかという根本問題もありますが．一点だけのデータでは，適合性もわからないので，みかけの値にしても Km という値を求めることの根拠もないわけで，そういう意味でも課題設定が無意味かつ不毛です．

No.2 回答者： c80s3xxx 回答日時： 2010/07/04 20:58

基質濃度一点しか測ってないなら，Km値を計算する方法はありません．

「Km値を求めないといけない」なら，求められるような実験をしなくてはいけませんが，そういう実験をしていないのですから，求めようがありません．

適切な濃度範囲で基質濃度を4～5点以上くらい変えて速度を測っているなら，Lineweaver-Burk プロットなり，Eadie-Hofstee プロットなりで Km 値は求められます．NADH 過剰という条件で，ピルビン酸濃度を変えれば，ピルビン酸に対する Km が求められますが，NADH 過剰という条件を満たしているかどうか担保されていないなら，そこも検討する必要があります．

ここまで書いたついでにいうと，解析方法もわからずに実験作業をするのは無意味です．順番が逆です．

この回答への補足

Kｍ値を求める実験ではないと思っていたのですが、
実習レポートの課題としてKm値を求めなさいと言われてしまい、
自分の中で？？？となってしまったんです。
先輩に聞いたところ、最適条件からKm値が求められると言われたんですが、
よく分からないので困っています。

0.1ｍMリン酸緩衝液2.63ｍｌ
100ｍMピルビン酸ナトリウム0.3ｍｌ
10ｍM　NADH0.06ｍｌ
ホモジネート0.01ｍｌ

ホモジネートを入れる前の吸光度は1.045
NADHの濃度は0.17ｍMと分かる
ホモジネートを入れてから１５秒ずつ、３分間吸光度を測り続けた
この結果から吸光度は減少率は0.416
酵素活性は０．０２×10＾6

ビュウレット法によりホモジネートのたんぱく質濃度を求めた、
たんぱく質濃度は.35ｍｇ/ｍｌ
酵素の比活性は14.97
と求められました。

これらの結果からKm値を求めることはやっぱり不可能なことですか？

補足日時：2010/07/04 21:40

No.1 回答者： cvaa 回答日時： 2010/07/04 18:00

気質濃度と、反応速度は１点ずつしかわからないんでしょうか??

この回答への補足

基質濃度は一点しかわからないです。
ブランクとして基質を入れずに測りましたけど、これは関係ないですよね？

反応速度は減少率から求めたものです。
なので一点だと思います。

減少率は吸光度の減少が一番激しいところで求めました。

補足日時：2010/07/04 18:06