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よくネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドをリポフェクションによって細胞に導入し、ネオマイシンによってセレクションを行って安定発現株を得ると言う実験が行われていると思います。
この安定発現株って、細胞がプラスミドをプラスミドの形で安定に保持し続けているんでしょうか?
それとも染色体内に組込まれて保持されているものなんでしょうか?
調べてみたけどよくわからなかったので、どうか教えて下さい。

A 回答 (3件)

一般的に



・一過性発現:トランスフェクション後、2~3でタンパク質の発現やフェノタイプをみる→プラスミドの多くはプラスミドのまま、存在。プラスミドの入っている細胞とプラスミドの入っていない細胞が混在(トランスフェクション効率による)

・安定発現株:トランスフェクション後、抗生剤(ネオマイシン/ハイグロマイシン/ピューロマイシン/ブラストサイジン/ゼオシンなど)によってプラスミドが染色体に組み込まれた細胞のみを選択する(数週間から数ヶ月間、抗生剤存在下で培養)→基本的には染色体に組み込まれた細胞のみが培養されているため、100%目的のプラスミドを含む(ただし、どのように/染色体のどこに組み込まれたかでプラスミドの持つ性質が生かされるかは個々の細胞で異なる)

実験的には、
・短期間(数日)でとりあえずの結果が知りたい時は一過性発現、ただし、細胞ごとにプラスミドが入っていたりいなかったりしている。
・時間をかけてでも(1ヶ月以上)すべての細胞に同じようにプラスミドが入っている細胞を使いたいときは安定発現株。

ただ、抗生剤や細胞株など行う実験によって若干変わってくるかと思います。例えば、一過性発現でもCOS7細胞にSV40 T antigenを出すようなプラスミドを入れた場合、長い間プラスミドが抜けずに実験が行えます。

また、使う抗生剤でも、ネオマイシン(G418)やBlastcidinのような「切れ」のよい抗生物質であれば、トランスフェクションした細胞に加えるとすぐにプラスミドの入っていない細胞が死んでしまうため、見かけ上、すべての細胞にプラスミドが入った状態(必ずしも染色体に組み込まれていなくてよい)で実験できます。言い方を変えれば、ゼオシンなどは、プラスミドの入っていない細胞が死ぬまで時間がかかるため、抗生剤を加えてセレクションしている間に染色体に組み込まれたものだけが生き残ります。

長くなってごめんなさい。
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哺乳類なら普通プラスミドのままDNAを安定に保持することはできなかったと思うので、相同性組み換えを起こして染色体に組み込まれたのではないでしょうか。

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染色体です。

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QG418の濃度(セレクション)

これからネオマイシン耐性のプラスミドを導入してセレクションを行うために、プラスミド導入前の細胞がどの程度のG418濃度でアポトーシスが誘導される検討を行っているのですが、力価として3000 μg/mLまで濃度を上げましたが全然死んでくれません。

細胞は株化された血管内皮細胞なんですが、wakoの試薬情報では哺乳系細胞では100~2000 μg/mLとなっています。

今後、G418濃度を上げ続けてセレクションするのがよいのか、それともいっそのこと耐性遺伝子を変えてしまうのがよいのか迷っています。

どなたかアドバイスよろしくお願いします。

Aベストアンサー

ほとんどの細胞はある程度のG418を加えると、細胞分裂が遅くなります、経験上。
それを考慮にいれて1週間くらい継代なしで培養できるくらいの細胞数ではじめます。
しかし、あまりに少なすぎると、通常の濃度よりも低いところで死にやすくなりますのでご注意を。

もともと、遺伝子を導入した細胞をセレクションする場合、セレクションられた細胞が増えるまでの期間が2~3週間かかりますので、それを想定して1週間くらいで死ぬ薬剤の量を継代なしで検証する必要があります。

継代するとその行為で細胞が痛みますので、正確な検証ができません。
独学とのことですが、こういう実験はやったことある方に、実際に細胞を見せてもらいながら教えてもらうことが重要です。

Qエクセル STDEVとSTDEVPの違い

エクセルの統計関数で標準偏差を求める時、STDEVとSTDEVPがあります。両者の違いが良くわかりません。
宜しかったら、恐縮ですが、以下の具体例で、『噛み砕いて』教えて下さい。
(例)
セルA1~A13に1~13の数字を入力、平均値=7、STDEVでは3.89444、STDEVPでは3.741657となります。
また、平均値7と各数字の差を取り、それを2乗し、総和を取る(182)、これをデータの個数13で割る(14)、この平方根を取ると3.741657となります。
では、STDEVとSTDEVPの違いは何なのでしょうか?統計のことは疎く、お手数ですが、サルにもわかるようご教授頂きたく、お願い致します。

Aベストアンサー

データが母集団そのものからとったか、標本データかで違います。また母集団そのものだったとしても(例えばクラス全員というような)、その背景にさらならる母集団(例えば学年全体)を想定して比較するような時もありますので、その場合は標本となります。
で標本データの時はSTDEVを使って、母集団の時はSTDEVPをつかうことになります。
公式の違いは分母がn-1(STDEV)かn(STDEVP)かの違いしかありません。まぁ感覚的に理解するなら、分母がn-1になるということはそれだけ結果が大きくなるわけで、つまりそれだけのりしろを多くもって推測に当たるというようなことになります。
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Q脱イオン水、MilliQ、蒸留水 の違いを教えて下さい

こんにちは。お世話になります。

バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。

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よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。

イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。

蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。

逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。

限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。ただ、普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。

超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。MilliQに関してはイオン交換樹脂を通し、逆浸透法、限外濾過法を用いて精製しているようです。

>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?
これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)

>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?
これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。

ただ、水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。

実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。

pinokoBBさん、こんにちは。

バイオ・生化学関係に用いられる水は水道水をプレフィルターを通し、イオン交換・蒸留・逆浸透法、限外濾過などを複数回組み合わせて生成します。

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Q限界希釈法について

細胞の分離・純化法で限界希釈法というものがあるのですが、この詳しい説明ができる方誰かいませんか?

Aベストアンサー

細胞懸濁液をかなり薄く培地でうすめて,96穴などに1滴ずつピペット落とします.このまま2~3週間37℃で培養すると,1つの細胞から広がったコロニーができます.これを徐々にスケールアップ(96穴-24穴-6cmディッシュ・・・)するのが限界希釈法です.

かなり薄く懸濁したほうがいいです.シングルセル由来のクローンをとりたいということであれば.

Qエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分け

エタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。
別に70%エタノールで洗浄して、もう一度70%エタノールで洗浄してもいいと思いますし、逆に両方とも100%エタノールでもいいのではないかと素人の私は思ってしまいます。
70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。
よろしくお願い致します。

Aベストアンサー

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けません。

ですが、エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。
塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。
なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。
70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。
30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。

簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。

そういうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。

エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。

DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。
通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。
すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。

このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので
最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?

そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。
もちろん100%エタノールにも溶けま...続きを読む

QDMEM培地について。

DMEM培地に含まれる

・グルコース
・L-グルタミン
・フェノールレッド
・HEPES

それぞれの効果というか意味を教えてください。

よろしくお願いいたします。

Aベストアンサー

L-グルタミンについては、
http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8
「培地にL-glutaminの添加は必要ですか?どの程度のL-glutaminを添加したらよいですか?なぜ information sheetにL-glutaminの記載がないのですか?」
を見て頂けると良いと思います。
最終的にはどの培地にも添加されます。

参考URL:http://www.summitpharma.co.jp/japanese/service/s_ATCC_faq_cell_biology.html#q8

Q細胞培養がうまくいきません。

接着性の細胞を液体培地で培養していますが、コンタミして困っています。
培養液には、抗生物質、抗真菌剤を加え、実験で使う器具はUV照射して使用しています。
培養容器は、フラスコです。インキュベーター内では、キャップを緩めて細胞が呼吸できるようにしています。
インキュベーターの湿度を保つために滅菌蒸留水を入れ、SDSを加えています。
ここで、ふと疑問なんですが、インキュベーター内でキャップを緩めなくてはならない場合は、アルコール消毒してからインキュベーターに入れたらよいのでしょうか?しなくてもよいのでしょうか?
現在は、インキュベーター内にフラスコを入れる際に、70%エタノールを吹き付けて入れているんですが、これだと、カビが生えてしまいます。(フラスコの外側に)

Aベストアンサー

まず下でfujishiroさんがおっしゃっている通り、培養液がコンタミしていないかを調べてみるべきだと思われます。冷蔵庫に入れてあると菌が繁殖しづらく、確認しづらいので、一日、室温に置いておきます。翌日、ビンを振ってみて白いものがユラユラとしていたらコンタミってことになります。

僕は使用する器具・試薬はすべて乾熱滅菌・オートクレーブ・ろ過滅菌を行っています。そして、たとえエタノール消毒していたとしても「手が触ったところは菌が付いている」と思ってそれらを使用しています。
あと以外と気が付かないところが原因だったりします。例えば誰かがピペット操作のときにニップルまで培養液を吸い上げてしまったのに、それに気づかず放置。後の人がそれを使ってコンタミだらけ・・・なんてこともあると聞きます。

あと、インキュベートについてですが、基本的に外側を消毒しなくても中身は平気です。70%エタノールを吹きつけてカビが生えるということはインキュベーター内の環境がよくないのではないでしょうか?一度、チェックしてみて、必要があれば掃除・滅菌をした方がいいでしょう。他の実験者の方(操作に慣れている方)のディッシュにも同じことが起こっているのでしょうか?

ちなみに失礼ですがkumanokophooさんは培養を始めて間もなかったリするでしょうか?始めのうちは気をつけているつもりでも、どうしてもコンタミの洗礼を受けてしまいます。でもしばらくすると慣れてきて失敗しなくなりますよ。

まず下でfujishiroさんがおっしゃっている通り、培養液がコンタミしていないかを調べてみるべきだと思われます。冷蔵庫に入れてあると菌が繁殖しづらく、確認しづらいので、一日、室温に置いておきます。翌日、ビンを振ってみて白いものがユラユラとしていたらコンタミってことになります。

僕は使用する器具・試薬はすべて乾熱滅菌・オートクレーブ・ろ過滅菌を行っています。そして、たとえエタノール消毒していたとしても「手が触ったところは菌が付いている」と思ってそれらを使用しています。
あと以外と...続きを読む

Qエタ沈後のペレットを確実に溶解させるには

プラスミドのTE(pH8)に対する溶解度は高いんですか?

エタ沈後、エタノールを除去するとプラスミドの沈殿が残りますが、
これをTEに溶かすことがあるんですが、どのようにして溶かしたら
いいんですか?
溶解度が高いんならほっとけばいいと思いますが。
エタ沈はWAKOのエタ沈メイトというキットを使っています。

また、大量のエタノールを入れて精製した場合、チューブの壁面に沈殿が付くと思いますが、沈殿後に加えるTEの液料が少ない場合は液に接しない壁面の沈殿はどうやって溶かせばいいですか?
ピペットで落とすしかないんでしょうか?

また、完全に溶解したかどうかはどうやったら確認できますか?
透明になっていれば溶解したということになるんでしょうが。
沈殿自体が見えにくいのでなかなか苦労しています。

Aベストアンサー

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真空乾燥させると、溶液中に回収できずチューブに残る放射活性が非常に高いことがわかります。室温で放置、または37度くらいで穏やかに温めて乾燥させるのがいいです。

2.Mg++が存在するとDNAが非常に溶けにくい塩を作って溶けにくくなります(逆にこれを利用してEtOH沈殿の回収率を高める方法もあります)。これは純水に溶かそうとするときには難儀ですが、TEに溶かすのであればキレートされるのでそれほど問題ではありません。

沈殿を少量の溶媒に溶かすときには、タッピング(チューブの底をはじく)で、溶媒が十分な範囲をなめるようにすると良いでしょう。チューブの性質にもよりますが、沈殿が付いているところは、水はじきが悪くて液が残ります。壁に付いた液が軽くはじいただけできれいに取れるようになったら、溶けていると溶けたと思っていいでしょう。
また、おおよそ10 kb以下の小さなプラスミドならVortexを使ってもかまいません。

プラスミド自体の溶解度は悪くありません。
また、よっぽど大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。たまに、全然溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。

ただし、操作によって非常に溶けにくくなることがあります。
1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真...続きを読む

Qトランスフェクションでの培地について

学生で実験初心者です。
HEK293細胞へのトランスフェクションの際、opti-memまたは血清なしのDMEMを使用すると卒業生のプロトコールノートに記載してありました。

今まで、opti-mem=血清の入っていない培地でトランスフェクションで使用、DMEM=血清入り培地で細胞の培養時に使用、という風に思い使用していたため、混乱してしまいました。

opti-memとDMEMの違いは何なのでしょうか?

また、opti-memと血清なしDMEMで導入効率に差が生じる原因についてもご存じでしたら、こちらの方もご回答よろしくお願いします。

Aベストアンサー

opti-menはインビトロジェン社(現:ライフテクノロジーズ社)から販売されている
インビトロジェン社の形質転換試薬(リポフェクタミンなど)に最適された培地です。

血清なしの培地です。

リポフェクタミンと核酸の複合体を形成させるときに、様々な成分が邪魔をするらしく(イオン的な要因だとか・・・)、
opti-menは邪魔をする成分を極力除去した培地だと思ってください。

一応、核酸とリポフェクタミンの複合体の形成はopti-menを使うのが原則(血清も抗生剤も入れない)

複合体の形成をopti-menで行えば、あとはDMEM血清含有で良いみたいです。
昔は細胞もopti-men血清なしで形質転換して、8時間御くらいに血清含有DMEMに培地交換することもありましたが
リポフェクタミン2000以降に開発された試薬は簡略化していいという声を聞きます。

先輩のプロトコールで問題がないのでしたら、それに従ってください。
あとは試薬のマニュアルをよく読んでください。

Qpoly-Aとは

poly-Aとはなんでしょうか?
あとpoly-A付加シグナルについても教えてください。

Aベストアンサー

プロセッシングが完了し完成したmRNAの3'末端には、50~200塩基ほどのアデニン(A)ヌクレオチドが付加されています。これがpoly-A tailです。poly-A tailはmRNAに安定性をあたえ、翻訳を促進する働きがあると考えられています。

mRNAは、まず遺伝子のプロモーターからエクソン、イントロンを含め連続的に転写され、転写の終結部は最後のエクソンよりかなり下流に及びます(真核生物では転写終了位置を示すシグナル配列のようなものは見つかっていません)。
この一時転写産物はイントロンを削除しエクソンを連結するスプライシング、5'末端に一個の7-メチルグアノシン(7-m G)を付加(cap構造といいます)するcapping、3'末端にpoly-A tailを付加するpolyadenylationを経て成熟mRNAになります。

poly adenylationは、最終エクソン内のAAUAAAという配列(polyadenylation signal ポリアデニル化シグナル, poly-A additional signal ポリA付加シグナル)を認識するpoly-A polymerase ポリAポリメラーゼによって行われます。この酵素はポリアデニル化シグナルの10~30塩基下流で一時転写産物を切断するとともに、鋳型に依存せずにアデニンを付加します。なお、ポリアデニル化シグナルには例外も知られています。

参考URL:http://opbs.okstate.edu/~melcher/MG/MGW2/MG234.html

プロセッシングが完了し完成したmRNAの3'末端には、50~200塩基ほどのアデニン(A)ヌクレオチドが付加されています。これがpoly-A tailです。poly-A tailはmRNAに安定性をあたえ、翻訳を促進する働きがあると考えられています。

mRNAは、まず遺伝子のプロモーターからエクソン、イントロンを含め連続的に転写され、転写の終結部は最後のエクソンよりかなり下流に及びます(真核生物では転写終了位置を示すシグナル配列のようなものは見つかっていません)。
この一時転写産物はイントロンを削除しエクソンを連...続きを読む


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