プラスミドDNAの精製

シークエンス反応に使うプラスミドDNAを抽出したのですが、反応が十分に行かないのか、塩基配列をあまり読むことができません。サンプルのプラスミドDNAの純度に問題があるような気がするのですが、純度がよいDNAを抽出する方法を(経験)コツなどを含めてご教授願えますでしょうか。
プラスミドDNAは大腸菌から抽出します。シークエンス反応はサイクルシークエンス法です。泳動はアクリルアミドゲルで行っております。

No.1 回答者： tomoki 回答日時： 2005/05/18 22:46

プラスミドの抽出はどうやってますか？Qiagenなどのキットでやればまったく問題ない純度のDNAがとれます。

シーケンスの時バックのノイズが多くて読めないのであればシーケンスPCRのテンプレートのプラスミドDNA量が多すぎる、などの問題かもしれません。
また、シーケンスPCRのあとエタ沈してると思いますが、このとき通常のように低温でエタ沈（遠心を４度でやる、静置をー２０度でやるなど）すると塩が析出して汚くなります。

周りにうまくいっている人はいませんか？確立された技術ですのできっとちょっとしたことでうまくいくと思います。がんばってください。

この回答への補足

　プラスミド抽出はアルカリ法で行っております。
最後はエタ沈し、そのサンプルをシークエンスサンプルとして使っております。PEG沈を行うと、抽出の仕方が悪いのかもしれませんが、かえって伸びません。PEG沈のコツなどあれば教えていただけないでしょうか。
　シーケンスPCRのあとエタ沈はしておりません。そのままダイを入れて泳動しております。1サンプルについてAGCT4チューブありますので、かなり労力がいることになります。
　エタ沈で低温でやらない方が良いとのことですが、アルカリ法の最後のエタ沈の時にも低温より常温でやる方が良いということでしょうか？

補足日時：2005/05/18 23:01