A 回答 (3件)
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No.3
- 回答日時:
短い方(目的のcDNA由来)は増えるけれど、長い方(ゲノム由来)が増えない、増えにくい条件設定が必要です。
400 bpと850 bpだと、どちらも十分に短いのでcDNA由来だけを増やすのは難しいと思います。
No.2
- 回答日時:
QiagenのRNeasyは、もっともDNAのコンタミがなく、信頼性の高いキットの一つだと思います。
これのあとISOGEN処理(グアニジンチオシアネート・酸性フェノール抽出法だと思いますが)をするのはあまり意味がないように思います。順番が逆なら頷けますが。
マニュアルに忠実に従ってやれば(たとえばオーバーロードしないとか)、ふつうはRNeasyだけで十分ですが、ごく微量のDNAのコンタミが問題になるときは、同じ会社からRNeasy用に出しているDNaseを試してみてください。
またAmbionのキットも評判がいいです。もしQiagenに不満を感じるなら試して見るのもいいでしょう。
とはいえ、完璧にDNAのコンタミをzeroにできるキットもDNaseもないと思ってください。程度の問題です。
どうしても、DNAからPCRが増えてくるようなら、大きめのイントロンを挟んだプライマーを設計するに限ります。
この回答へのお礼
お礼日時:2006/02/24 11:18
ご回答ありがとうございました。
一応、RT-PCRのコントロールとしてEF1αのイントロン
450bp+エキソン400bpを挟んだプライマーを設計しているのですが、泳動してみると850bpと400bpのバンドがでてしまいます。もう少し長めのイントロンを挟んだ方が良いのでしょうか?
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