No.1ベストアンサー
- 回答日時:
RTのあとのPCRのデザインによってはそれで良いですし、これまで使ってこられたのもそういうプライマーだったのかと思いますが、どうせオーダーメイドなら一工夫しても良いと思います。
これが効いてくるのは、特に3'RACEのときで、Gene specific primer対でPCRするだけならあまり関係ないのですが、
1. 5'-(dT)n-(A or C or G)'とか、 5'-(dT)n-(A or C or G)-N-3'のように、3'末端の1~2塩基ををdegenarateする。こうするとoligo-dTがpoly-A tailの根元に付いたものだけのcDNAが逆転写される。単純に(dT)nだけだと、poly-A tailのいろいろな位置からプライミングされてしまうため、長さが微妙に異なるPCR産物の混合物になってしまう。なお、3' RACEにoligo dTをプライマーを使うときも、このようにdegenerateしたものを使ったほうがよい。
2.(dT)nの5’側にユニークなアンカー配列をデザインする。(dT)nだけだとTmが低くすぎて、PCRに支障をきたす。また、アンカー配列に対するプライマーを使えばよりreliableだし、必要ならnested PCRもできて便利。
clontechのMarathon kitのプライマーデザインが参考になるかと思いますので、マニュアルpdfのリンクをはっておきます。なお、プライマー合成のとき、degenerate nuleotideを入れるのは、ふつう追加料金なしです。
参考URL:http://www.clontech.com/clontech/techinfo/manual …
この回答へのお礼
お礼日時:2006/05/10 11:54
とってもわかりやすい回答をどうもありがとうございました。
教えていただいたプロトコルを見ると、とくに修飾なくそのままTの配列を並べた設計でよいみたいです。
さっそく設計してプライマーを注文してみます。
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